前言

轉錄組測序（RNA-seq）是當下最流行的二代測序（NGS）方法之一，使科研工作者實現在轉錄水平上定量、定性的研究，它的出現已經革命性地改變了人們研究基因表達調控的方式。然而，轉錄組測序（RNA-seq）其實是廣泛的概念，面對眾多的RNA-Seq技術，常常難以選擇最合適的方法。本文將概述幾種主要的 RNA-Seq 技術，并探討它們的應用和優勢。

轉錄組測序技術（RNA-seq Tech.）

下面的表格比較了幾種常見的 RNA-Seq 測序方法，并對每種方法進行了簡述。熟悉這些技術將有助于我在設計實驗時做出明智的決定。

RNA-Seq分析方法比較

類型	目標RNA	RNA選擇方法	起始材料	相對成本
mRNA-Seq	mRNA	Poly(A)選擇：利用mRNA尾部的poly(A)尾巴進行分離	總RNA、細胞、組織	🙂
總RNA-Seq	mRNA + lncRNA	去除核糖體RNA，留下其他類型的RNA	總RNA、細胞、組織	🙂🙂
鏈特異性 RNA-Seq	mRNA和/或lncRNA	Poly(A)選擇或rRNA去除	總RNA、細胞、組織	🙂🙂
小RNA-Seq	小非編碼 RNA（miRNA、siRNA、piRNA）	尺寸分級分離（通過大小分離小RNA，并連接接頭到5’磷酸用于測序）	總RNA、細胞、組織	🙂🙂
超低起始量RNA-Seq	mRNA	Poly(A)選擇	總RNA（<500 ng）或細胞（<10,000）	🙂🙂🙂
單細胞RNA-Seq	mRNA	分離單個細胞后的Poly(A)選擇 補充說明：用于研究單個細胞的基因表達差異。	細胞/細胞核	🙂🙂🙂🙂
Iso-Seq	全長 mRNA	Poly(A)選擇	總RNA	🙂🙂🙂🙂

mRNA = 信使RNA，編碼蛋白質的RNA
lncRNA = 長鏈非編碼RNA，不編碼蛋白質但具有調控功能的RNA
miRNA = 微小RNA，調控基因表達
siRNA = 小干擾RNA，參與RNA干擾
piRNA = Piwi相互作用RNA，與生殖細胞發育相關
rRNA = 核糖體RNA

信使RNA測序 (mRNA-Seq)

在真核生物中，成熟mRNA轉錄本具有5’端帽子結構和3’端多聚腺苷酸尾，可通過poly(A)選擇特異性富集。具體步驟包括：首先提取總RNA，隨后利用寡聚(dT)偶聯的磁珠/柱進行雜交，或使用寡聚(dT)引物進行逆轉錄。由于多聚腺苷酸化的RNA分子在大多數物種中僅占總RNA的1-5%，因此poly(A)選擇后的樣品濃度通常會降低20-100倍。純化的mRNA隨后被轉化為cDNA文庫，并通過PCR擴增以提高文庫濃度。值得注意的是，PCR擴增可能引入偏差，建議使用最少的擴增循環數(通常12-15個循環)。此外，poly(A)選擇可能導致3’端偏差，特別是在RNA部分降解的樣本中。盡管存在這些局限性，poly(A)選擇仍是真核mRNA文庫制備中最經濟且最廣泛使用的方法。

總RNA測序 (Total RNA-Seq)

總RNA-Seq適用于對蛋白質編碼RNA和各類非編碼RNA進行全面分析。這些非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA (lncRNA)、環狀RNA (circRNA)和其他調控RNA。特別是lncRNA，它們在基因組中具有重要的表觀遺傳調控功能，但由于很多lncRNA缺乏poly(A)尾，在常規mRNA-Seq中往往被忽略。在總RNA-Seq中，需要先去除占比高達80-90%的核糖體RNA (rRNA)。主要的rRNA去除方法包括：

1. Ribo-Zero技術：使用與rRNA互補的生物素化探針；
2. RNase H方法：使用DNA寡核苷酸引導RNase H特異性降解rRNA；
3. rRNA反義寡核苷酸捕獲法：使用互補序列直接捕獲并去除rRNA；

鏈特異性RNA測序 (Strand-Specific RNA-Seq)

轉錄本的極性信息對于基因功能注釋和轉錄組分析至關重要。由于真核基因組中存在大量重疊基因和反義轉錄本，識別轉錄本的來源鏈可以提供重要的調控信息。然而，在標準RNA-Seq文庫制備過程中，轉錄本的極性信息常常丟失。鏈特異性RNA-Seq通過特殊的文庫制備方法保留了這些關鍵信息。主要的鏈特異性文庫構建方法包括：

• dUTP第二鏈標記法：在第二鏈cDNA合成時加入dUTP，后續選擇性降解含U鏈（如下圖）；
• 5’端接頭連接法：利用RNA分子5’端的帽子結構定向連接接頭；
• 3’端接頭連接法：在RNA片段化后進行定向接頭連接；
• 鏈特異性測序可以與mRNA-Seq或總RNA-Seq結合使用，能夠：準確鑒定反義轉錄本；分析重疊基因的表達；研究順式/反式調控元件；提高轉錄組拼接的準確性等；
  

鏈特異性RNA文庫制備。在第二鏈合成過程中摻入dUTP以及隨后的尿嘧啶特異性消化可以選擇性地保留第一鏈cDNA

小RNA測序 (Small RNA-Seq)

小 RNA，如 microRNA (miRNA) 和小干擾 RNA (siRNA)，在基因調控中發揮著重要作用。Small RNA-Seq 通過尺寸分級分離從總 RNA 中選擇小 RNA 進行測序。文庫制備通常包括將測序接頭連接到 Dicer 修飾的小 RNA 5’ 磷酸末端。小 RNA 片段隨后被逆轉錄成 cDNA 并進行測序。由于小 RNA 分子長度較短 (可短至 21 個核苷酸)，可以使用較少的測序循環數 (例如 1×50 bp)。

超低起始量RNA測序 (Ultra-Low Input RNA-Seq)

標準 RNA-Seq 方法通常需要大量的完整 RNA (>500 ng)。對于 RNA 產量低或降解的樣品，需要額外的擴增步驟和更高的測序深度以提高數據輸出，但這容易導致轉錄偏差。超低起始量 RNA-Seq 方法能夠選擇性擴增全長轉錄本，同時最大限度地減少偏差，使得研究人員能夠對少量細胞的樣品進行 RNA-Seq。

單細胞RNA測序 (scRNA-Seq)

與傳統的“批量”RNA-Seq 不同，scRNA-Seq 能夠捕獲單個細胞的轉錄組，揭示復雜細胞群體中基因表達的異質性。scRNA-Seq 通常使用微流體（華大、10X等）或微孔技術(華大、BD、新格元等)分離單個細胞，并在文庫制備過程中為每個轉錄本添加唯一的條形碼，以便通過生物信息學分析追溯到其來源細胞。

全長轉錄本測序 (Iso-Seq)

Iso-Seq 技術，例如 PacBio? 開發的平臺，使用長讀長測序技術對全長轉錄本進行測序，無需組裝。 這使得能夠直接識別轉錄本起始位點、多聚腺苷酸化位點和剪接位點。Iso-Seq 可用于表征轉錄組中的所有異構體，其應用包括基因組注釋、基因融合檢測和新異構體的發現。可變剪接導致單個基因編碼多種異構體，這可以通過Iso-Seq有效地進行分析。

選擇指南

選擇合適的 RNA-Seq 測定方法取決于幾個因素，包括：實驗目標、感興趣的 RNA 種類（編碼、非編碼或兩者）
、材料、是否有參考轉錄組等。準確定義生物學問題至關重要，有一個清晰而具體的目標將幫助確定需要哪種類型的 NGS 數據，進而確定哪種 RNA-Seq 方法最合適。 下面是一個簡化的樹，可以輔助決策