通過多區域單細胞測序解析肺腺癌的空間和細胞結構
摘要
對于肺腺癌演進過程中單個細胞群的地理空間架構知之甚少。在此，我們對來自5例早期LUAD和14個來自腫瘤的具有明確空間鄰近性的多區域正常肺組織的186，916個細胞進行了單細胞RNA測序。我們發現細胞譜系、狀態和轉錄組特征在正常區域到LUAD的地理空間上發生了演變。LUAD還表現出單個部位內顯著的腫瘤內細胞異質性以及轉錄譜系可塑性程序。與腫瘤鄰近的正常組織中調節性T細胞表型增加，而細胞毒性CD8+T細胞、抗原呈遞巨噬細胞和炎癥樹突狀細胞的特征和比例則減少。我們還發現LUAD配體-受體相互作用組中上皮CD24的表達增加，其介導了促腫瘤表型。這些數據提供了LUAD演進的空間圖譜，并為識別其治療靶點提供了資源。
數據收集
LUAD patient
軟件使用
軟件包信息
軟件名稱 | 版本 | 類型 | 應用領域 | 官方鏈接 |
|---|---|---|---|---|
| NovaSeq 6000 | - | 測序平臺 | 高通量測序 | illumina.com |
| 10X Genomics | - | 單細胞平臺 | 單細胞測序 | 10xgenomics.com |
| Seurat | - | R包 | 單細胞分析 | satijalab.org/seurat |
| Seurat v3 | - | R包 | 單細胞分析 | satijalab.org/seurat |
| Harmony | - | R包 | 批次校正 | github.com |
| Monocle 2 | 2.10.1 | R包 | 擬時序分析 | bioconductor.org |
平臺與工具關系
graph LR
A[NovaSeq 6000] -->|生成數據| B[10X Genomics]
B -->|CellRanger處理| C[Seurat]
C -->|整合分析| D[Harmony]
C -->|軌跡分析| E[Monocle 2]統計方法信息
參數檢驗
非配對Student's t檢驗 (Unpaired Student's t-test)
核心假設：
正態性（Shapiro-Wilk檢驗p>0.05）
方差齊性（Levene檢驗p>0.05）
觀測獨立性
R語言實現：
# 標準t檢驗（方差齊） t.test(value ~ group, data, var.equal =?TRUE)# Welch校正（方差不齊） t.test(value ~ group, data, var.equal =?FALSE)
實驗驗證方法
多區域樣本采集與處理
目的
解析肺腺癌瘤內異質性和微環境特征
實驗設計
樣本類型：
腫瘤核心區（≥3個解剖位置）
腫瘤-正常交界區
遠端正常肺組織（距腫瘤>5cm）
采樣規范：
graph TDA[手術切除] --> B(30分鐘內處理)B --> C{分區取樣}C --> D[腫瘤中心]C --> E[浸潤邊緣]C --> F[遠端正常]
研究成果
通過多區域單細胞RNA測序剖析早期肺腺癌及周圍肺部生態系統
A 展示了針對5個肺腺癌樣本和14個具有明確空間定位的正常肺組織，采用多區域采樣策略進行單細胞RNA測序分析的流程圖。
B 來自患者一的腫瘤樣本、鄰近正常樣本和遠端正常樣本的細胞的均勻流形逼近與投影嵌入圖。
C 每個空間樣本中細胞的絕對數量組成和相對比例分別來自P1。
D 來自所有5名患者的細胞的UMAP視圖，包括P2-P5中的EPCAM+和EPCAM-前富集細胞。
E 基于空間樣本的細胞類型及其比例的UMAP視圖。
F 顯示基于使用轉錄組特征計算的歐幾里得距離的空間樣本中細胞之間層次關系的樹狀圖。
G 與圖D中相同的UMAP，還包括淋巴細胞和髓細胞的進一步分層。
H-I 折線圖展示了所有患者總體以及按患者劃分的各空間樣本中EPCAM陰性子集的相對比例變化情況。
早期肺腺癌空間生態系統中的上皮細胞譜系多樣性及腫瘤內異質性
A、所有EPCAM+細胞的UMAP圖形展示。
B、EPCAM+細胞簇的主要譜系標記基因熱圖，同時附有相應的條形圖，用于說明不同空間樣本中的比例情況。
C、顯示不同空間樣本中EPCAM+子集比例變化的面積圖。
D、基于計算的歐幾里得距離使用轉錄組特征對空間樣本中的3個代表性上皮細胞子集之間的層次關系進行展示，以及相應量化空間樣本之間相似度水平的熱圖。
E、惡性富集簇C9中細胞的UMAP圖形，按其對應的患者來源、空間樣本和CNV分數進行著色。
F、攜帶KRAS G12D突變的細胞比例，數字表示絕對細胞數量，以及表達水平。
G、通過使用NK細胞作為對照，對來自患者P3和P5腫瘤樣本的CNV路徑圖進行無監督聚類分析
H、通過Monocle 3分析推斷出P3和P5中EPCAM+細胞的潛在發育軌跡。
早期肺腺癌中淋巴細胞亞群向腫瘤相關表型的時空重編程
A、對P1-P5時期淋巴細胞亞群進行的UMAP可視化處理，按細胞譜系和空間樣本進行著色。
B、氣泡圖展示譜系標志物的表達情況。
C、在LUAD和空間正常樣本中淋巴細胞譜系及細胞狀態的變化情況。
D、對CD8+T淋巴細胞進行UMAP可視化處理，按細胞狀態、空間樣本和細胞毒性評分進行著色
E、在肺癌組織微環境中清除CD8+GNLY高表達的CTL細胞。
F、CD4 T淋巴細胞的UMAP圖。
G、在LUAD的腫瘤微環境中CD4+T調節細胞的富集情況。
早期肺癌組織微環境中抗原呈遞和炎癥性樹突狀細胞的特征顯著減少
A 早期LUADA微環境中抗原呈遞和炎癥樹突細胞的特征減少，髓系細胞譜系的UMAP可視化圖以及空間樣本。
B 圖展示髓系細胞表達譜系特異性標記基因的百分比以及它們的縮放表達水平）。
C 圖顯示LUAD及空間正常肺樣本中髓系細胞亞群的豐度變化。
D 圖是單核細胞和巨噬細胞亞群的UMAP圖，按細胞類型/狀態、空間樣本和抗原呈遞評分進行顏色編碼。
E 圖顯示空間樣本中表達抗原呈遞基因的M2型巨噬細胞簇1的百分比及其縮放表達水平。
F 圖是脊線圖。在M2型巨噬細胞簇1中以及在LUAD樣本和空間正常肺樣本中，MHC類I和MHC類 II基因表達密度的分布情況如下。
G 箱線圖展示了所有患者以及患者內部在LUAD和空間正常肺樣本中M2型巨噬細胞的抗原呈遞評分。
H 樹突狀細胞的UMAP圖，根據細胞狀態進行顏色編碼和空間樣本。
I UMAP圖顯示cDC2細胞的無監督子聚類，根據簇ID進行著色、空間樣本以及計算出的炎癥特征評分。
J 顯示cDC2細胞亞群標記基因的標準化表達的熱圖。
K 氣泡圖顯示表達炎癥和非炎癥特征基因的cDC2細胞的百分比以及其縮放表達水平。
L 顯示了細胞中炎癥特征評分在來自cDC2集群C2的TME中的表達情況的維尼圖圖示。
M 展示了cDC2 C2細胞在總cDC2細胞中的比例以及在LUAD和空間正常肺組織中的分布情況的箱線圖。
N 展示了正常肺、癌前不典型腺瘤樣增生以及來自獨立隊列的LUAD中的炎癥特征評分
增強的配體-受體細胞-細胞間通訊網絡在肺腺癌細胞與其免疫微環境之間
A. 利用iTALK進行細胞間通訊的計算分析工作流程。
B. 熱圖顯示了基于預測的配體-受體相互作用在個體LUAD與相應空間分布的正常肺組織之間的重疊情況。
C-F. 代表性的環形圖展示了患者2、3、4和5的免疫檢查點介導的L-R對之間的詳細比較。
G-H. 條形圖顯示了涉及免疫檢查點的配體和受體基因的表達。
與肺腺癌中CD24增多相關的促腫瘤表型
A、箱線圖展示在一組獨立的正常肺組織、癌前不典型腺瘤樣增生以及肺腺癌樣本中CD24表達水平的情況
B、使用皮爾遜相關系數繪制的散點圖，展示NL、AAH和LUAD樣本中CD24與EPCAM和PRF1的水平關系。
C、箱線圖描繪了TCGA LUAD隊列中LUAD和匹配的正常肺組織中CD24表達水平
D、使用皮爾遜相關系數展示CD24與EPCAM或PRF1表達之間的相關性散點圖。
E、通過靶向免疫分析對早期LUAD患者進行分析，并根據中位CD24 mRNA表達進行二分
F、散點圖展示使用皮爾遜相關系數展示CD24與EPCAM、PRF1或細胞毒性評分在MDACC隊列中的表達相關性。
G、顯示相對較高和較低免疫組化CD24染色的代表性圖像。
H、體內MDA-F471細胞的生長情況
Reference
Sinjab A, et al. Resolving the Spatial and Cellular Architecture of Lung Adenocarcinoma by Multiregion Single-Cell Sequencing. Cancer Discov. 2021 Oct;11(10):2506-2523. doi: 10.1158/2159-8290.CD-20-1285. Epub 2021 May 10. PMID: 33972311; PMCID: PMC8487926.
