背景
雙特異性抗體（bsAb）是一種有前途的藥物形式，能夠同時結合相同或不同抗原上的兩個不同表位。迄今為止，已有14個雙特異性抗體藥物獲得上市批準，盡管取得了這些成功并且迄今為止設計了多種形式，但具有高純度和穩定性的雙特異性抗體仍具有挑戰性。
2024年3月25日，瑞典研究學者Nyesiga?B等人在mAbs上發表了一篇名為“RUBY??- a tetravalent (2+2) bispecific antibody format with excellent functionality and IgG-like stability, pharmacology and developability properties.”的文章，該研究開發了一種名為RUBY的獨特雙特異性抗體格式，在穩定性、可制造性、半衰期和功能性方面包含全長IgG的特征，同時具有2 + 2的幾何形狀，即能夠同時以二價結合兩個靶點，為開發腫瘤定位雙特異性抗體和新的治療概念以及臨床研究提供了新思路。
RUBY的結構設計
RUBY的分子設計采用了獨特的結構，由一個IgG連接到兩個Fab域，通過多肽連接子（3×G4S）連接在IgG的C端末端。RUBY bsAb?因此由6條多肽鏈組成，它們是三種不同多肽鏈的雙拷貝：1) 由 IgG 的重鏈和附加Fab的輕鏈組成的長鏈；2）與IgG部分的VH1和CH1結構域結合的輕鏈；3）附加到IgG的Fab的輕鏈結合短重鏈。由于Fab是通過它們的輕鏈附加的，經典的輕鏈錯配對問題不會發生在RUBY中，正確配對的產物將包含所有正確的鏈。這是一個有價值的特征，因為輕鏈錯配對會導致藥物效價的嚴重變化，RUBY bsAb格式的第二個關鍵特征是使用VH-CH1和VL-CL對之間的界面突變，從而最大限度地減少聚集體和可溶性抗原結合片段的形成，以及引入突變以降低免疫原性的風險，來降低MHC II結合肽的形成風險。
RUBY bsAb的穩定性驗證
對選定的RUBY bsAbs進行了可發育性評估，包括測定溫度、剪切應力、膠體、凍融、血清和pH穩定性的研究。
BsAbs在64°C~74°C之間表現出良好的熱穩定性，同時具有出良好的剪切應力、膠體穩定性（它需要PEG濃度高于9%才能誘導50%的蛋白質損失）。通過雙重ELISA驗證其血清穩定性，發現其在生理條件下具有良好的穩定性，論是在高溫下還是在冷凍/解凍后都沒有發生降解，在高蛋白質濃度下也有高穩定性，并且對低 pH不敏感。這些結果進一步證實RUBY作為穩定bsAb通用格式的潛力。
RUBY bsAb的抗原結合特性和功能
通過雙ELISA驗證，RUBY bsAb能夠同時結合各自的靶標，且在IgG或附加的Fab中的抗原結合域的位置對其抗原結合能力影響較小。
CD40-EpCAM RUBY bsAb顯示出條件性CD40激活：bsAb僅在CHO細胞上表達的EpCAM存在的情況下誘導表達CD40的細胞激活，而在缺乏EpCAM表達的CHO細胞的類似設置中未觀察到激活。CD137-5T4 RUBY bsAb誘導有效的T細胞活化，通過在5T4存在的情況下干擾素（IFN）-γ釋放的劑量依賴性增加來測量，在沒有5T4的情況下，bsAb構建體驅動的T細胞活性不存在劑量依賴性增加，T細胞激活是通過bsAb觸發的5T4依賴性聚類誘導的CD137交聯介導的。這些數據表明RUBY格式在生成有條件功能的bsAb方面的優勢，旨在將免疫細胞與腫瘤細胞聯系起來并限制對靶組織的活性，從而最大限度地降低全身毒性的風險。
RUBY bsAb的FcγR結合特性
RUBY bsAb具有與人Fcγ受體相似的相互作用，IgG1構建物顯示出與mFcγRI，FcγRIIa，hFcγRIIIa 176 V的結合相當，具有與單克隆抗體相當的特征，從而允許開發依賴于這種相互作用的生物學功能。
RUBY bsAb 在小鼠和食蟹猴的驗證
RUBY bsAbs在小鼠和食蟹猴中顯示出與FcRn結合和單克隆抗體類似的藥代動力學特征。此外，通過評估RUBY bsAb攜帶LALA沉默的IgG1 Fc在小鼠中的藥代動力學特征，RUBY bsAb的血清濃度與相應的單特異性抗體相似，它們之間的半衰期差異很小。在食蟹猴實驗中，RUBY bsAbs也展現出類似單克隆抗體的藥代動力學特性，其在不同物種中的穩定性和藥代動力學表現與單特異性抗體相比，添加C端Fab以及向RUBY bsAb的可變域和恒定域引入突變對此類bsAb的PK特性沒有影響或影響很小。
RUBY bsAbs在體內定位于腫瘤
RUBY bsAbs在腫瘤細胞中顯示出高效的定位能力，能夠有效地到達并富集在表達相關抗原的腫瘤中，而使用單特異性抗體靶向CD40治療則使得較少的腫瘤細胞呈現IgG陽性。單特異性抗體或雙特異性抗體定位到腫瘤的能力取決于幾個因素，如大小、親和力和靶抗原的表達模式。通過動態光散射（DLS）評估RUBY bsAbs的流體動力學直徑與單特異性抗體之間幾乎沒有差異。RUBY格式非常適合開發用于定位于腫瘤或潛在其他相關組織的雙特異性抗體。
小結
本研究中，研究人員開發了一種名為RUBY的獨特雙特異性抗體格式，具有出色的生物物理和生物學特性。RUBY采用了特定的突變來限制聚集物和副產物可溶性Fab的形成，并減少免疫原性風險。這種格式在體內表現出高效的腫瘤定位能力，且具有類似IgG的性質和自然雙價靶標相互作用。此外，RUBY通過提高穩定性、降低免疫原性風險等方式，展現出很好的臨床開發潛力。
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