Sigma-Aldrich_胰蛋白酶用于細胞培養
細胞解離是細胞傳代過程中的一個步驟，即細胞從預處理表面分離，形成懸浮液。這些懸浮液對于傳代培養重新接種、細胞計數分析和細胞增殖非常重要。有多種蛋白水解酶可用來從粘附基質上脫離細胞，胰蛋白酶就是其中之一。
胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族成員，常用于脫離細胞。胰蛋白酶的最佳活性溫度為 37 °C，因此時常采用預熱胰蛋白酶的方法加速細胞脫離。然而，長期在高胰蛋白酶濃度下孵育可能會剝離細胞表面蛋白并殺死細胞，從而損害細胞。
細胞解離產品
胰蛋白酶性質
許多細胞類型都耐受胰蛋白酶。但對于需要無血清培養的蛋白質組學研究和實驗，通常要避免使用胰蛋白酶。根據應用和細胞類型，可以采用不同成分和濃度的胰蛋白酶。其部分性質如下。
EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：在存在鈣的情況下，粘附分子決定細胞-細胞以及細胞-基質間的相互作用。經常會在胰蛋白酶中添加EDTA，以與二價陽離子（Ca2+、Mg2+）螯合并削弱這些相互作用。
- 酚紅：pH?7-9范圍內，胰蛋白酶具有最佳活性。\在此范圍內，酚紅內含物使溶液呈粉紅色。由于環境條件，胰蛋白酶的pH可能變為酸性，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。用NaOH調節pH至7.4-7.6，可恢復胰蛋白酶活性。
- 稀釋液：為了幫助維持pH值和滲透壓平衡，濃縮胰蛋白酶可以用不含?Ca2+?或?Mg2+?的緩沖鹽溶液（例如?Hank?平衡鹽溶液）稀釋或溶解。部分胰蛋白酶產品還可用0.9%?NaCl稀釋。
- 來源和形式：胰蛋白酶的主要來源是豬，以凍干粉末或溶液形式提供。如需避免動物或微生物來源產品，重組牛胰蛋白酶也可由玉米表達制得（Trypzean?溶液）。
- 濃度：根據細胞類型和應用，胰蛋白酶以不同濃度使用。對于強附著細胞系，使用2.5％至0.25％（1X至10X倍稀釋）的胰蛋白酶。低濃度的胰蛋白酶（例如?0.05%）可用于需要保持細胞表面蛋白完整性的研究。
胰蛋白酶酶解方案
此方案在保持無菌環境（例如在層流生物監測罩中）的條件下進行。
- 將胰蛋白酶溶液、平衡鹽溶液（不含Ca+2和Mg+2的溶液）以及生長培養基預熱至37 °C。
- 檢查細胞以確保細胞健康且無污染。
- 從培養瓶中取出并丟棄培養基
- 用不含Ca+2和Mg+2離子的平衡鹽溶液輕輕沖洗細胞，然后除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗滌牢固貼壁的細胞。然而，對于敏感細胞，首選平衡鹽溶液。
- 將適量（0.5 mL/10 cm2）預熱后的胰蛋白酶溶液添加至培養瓶側壁。輕輕旋轉內容物以覆蓋細胞層。
- 將容器在室溫下孵育2-3分鐘。（孵育時間根據所選用的細胞系而異）。牢固貼壁的細胞可以在37 °C快速脫離。在顯微鏡下觀察細胞。脫離的細胞在顯微鏡下呈現圓形且有折射光。如果脫離的細胞少于90％，則將培養瓶再孵育2分鐘，并每隔30秒在顯微鏡下觀察一次細胞。
- 注意：防止細胞暴露于胰蛋白酶溶液時間過長（> = 10分鐘）。
- 細胞脫落后，加入2倍體積預熱的完全生長培養基以滅活胰蛋白酶。向細胞層表面輕輕移液培養基數次，以確保細胞回收率 > 95％。對于無血清培養物，以等摩爾濃度添加黃豆胰蛋白酶抑制劑以抑制胰蛋白酶。
- 注意：劇烈移液會導致細胞損傷。
- 將細胞懸液轉移至試管中，并以100-300g輕輕離心5-10分鐘。除去上清液，將細胞沉淀團輕輕重懸于預熱的完全生長培養基中。用血細胞計數器和臺盼藍排除法或自動細胞計數器，去除所需樣品以確定活細胞的細胞密度。?
- 將剩余溶液稀釋至接種密度，并將適量體積吸移至培養瓶中，然后將其置于培養箱中。
