IF6.7|多組學與網絡藥理學分析揭示龜齡集治療少精癥的機制

2024年10月28日，海軍軍醫大學張衛東教授團隊在Phytomedicine（IF=6.7）上發表了題為“Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway”的文章，龜齡集（GLJ）最早記載于宋代，可以緩解疲勞和遺精癥狀。臨床常用于治療早泄、勃起功能障礙和少精癥，有研究表明，GLJ可有效改善大鼠性功能障礙，早期研究中已經對GLJ進行體內外成分鑒定，但是GLJ在少弱畸精子癥（OAT）中的作用成分和作用機制尚不清楚。在本研究中，作者通過多組學和網絡藥理學相結合的綜合策略深入研究GLJ治療OAT的作用機制，首先采用環磷酰胺（CTX）建立了OAT模型，初步評價GLJ的藥理作用，隨后采用多組學和網絡藥理學整合分析來闡明潛在的機制。最后進行細胞驗證試驗，確定GLJ的潛在靶點和有效成分。

回復GLJ,獲取論文全文。

摘要

OAT是男性不育的最重要原因之一，具有三個主要特征：精液樣本中精子數量減少，形態異常，精子活力差。吸煙、飲酒和肥胖是OAT的主要因素。它們可導致精子細胞生長受損、精子濃度降低、性腺功能減退、血清睪酮（T）和黃體生成素（LH）水平降低。環磷酰胺（CTX）通常用于構建OAT模型，因為它能夠降低生殖器官的重量，降低精子數量和活力。目前，除手術治療外，他莫昔芬、克羅米芬等抗雌激素藥物以及輔酶Q10、維生素E等抗氧化劑被廣泛用于治療特發性男性不育癥，但這些藥物中的大多數并未在各國獲得批準用于治療OAT。越來越多的人需要發現更安全、更有效的臨床用藥，而中藥是一個有吸引力的選擇，因為一些草藥配方已被用于治療男性不育癥多年。GLJ可以緩解疲勞和遺精癥狀。臨床常用于治療早泄、勃起功能障礙和少精癥。早期研究中已經對GLJ進行體內外成分鑒定，但是GLJ在OAT中的作用成分和作用機制尚不清楚。在本研究中，通過多組學和網絡藥理學相結合的綜合策略深入研究GLJ治療OAT的作用機制。

圖1 圖文摘要

2.主要結果

2.1 GLJ****提高大鼠精子活性，調節血清性激素水平

CTX造模后第15 ~ 17天，OAT大鼠體重明顯下降，而GLJ- L和GLJ- H組大鼠體重減輕明顯慢于OAT模型組，GLJ能有效減緩CTX引起的體重下降（圖2A）。對附睪精液進行檢測和分析，OAT組大鼠精子數量和活力顯著降低，GLJ組大鼠精子數量和活力顯著增加（圖2B- C）。此外，OAT大鼠血清LH、FSH和T水平明顯降低，但GLJ治療后改善（圖2D-F）。睪丸H&E染色切片顯示， OAT組精子小管組織紊亂，小管形態萎縮，管腔內生精細胞數量明顯減少，經GLJ-H處理后，OAT大鼠精小管萎縮和生精細胞數量減少得到緩解（圖2G - L）。

圖2 GLJ對CTX所致OAT大鼠的影響。

2.2 大鼠血清和尿液的代謝組學和脂質組學分析

通過對OAT和GLJ引起的內源性差異代謝物（DMs）的分析，在尿液和血清樣本中分別鑒定出106種和85種內源性差異代謝物（圖3A-B）。代謝組學鑒定的88種DMs（尿液中37種，血清中51種）受GLJ調控（圖3D-E）。血清中65%的差異代謝物為脂質代謝物。因此，對血清進行脂質組學分析，鑒定出159種脂質DMs（圖3C），GLJ調節的54種DMs的包括33%的甘油磷脂，20%的甘油脂，17%的類固醇，6%的鞘脂等（圖3F）。在這些DMs中，OAT組花生四烯酸（AA）水平顯著高于Sham組，GLJ-L和GLJ- H組的AA水平顯著低于OAT組。同時，與AA相關的脂質DMs（PGE2、PGE2a、白三烯E4、12-HETE）在GLJ-L和GLJ-H組顯著升高。GLJ可以顯著逆轉OAT誘導的代謝物，特別是脂質代謝物的破壞。

圖3 通過代謝組學和脂質組學實驗鑒定了內源差異代謝物

2.3 DMs****的功能分析

將GLJ調節的DMs進行通路分析。3組的鞘脂代謝均被DMs富集，而甘油磷脂代謝和不飽和脂肪酸的生物合成途徑則被OAT組與Sham組或GLJ組與OAT組的DMs富集（圖4A）。最后確定了鞘脂代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和醚脂代謝4種途徑（圖4B）。接下來，構建一個由四個通路和相關的DMs組成的代謝物通路網絡（圖4C）。該網絡中的8種DMs在OAT組和GLJ組中相反表達，其中7種由OAT增加的代謝物在GLJ處理后被下調，尤其是花生四烯酸和鞘氨醇（圖4D）。對尿液中的54種DMs進行類似的分析，OAT組與Sham組中有3條通路富集（圖4E），其中DMs在11條通路中發揮關鍵作用（圖4F）。然而，在OAT vs Sham組和GLJ vs OAT組中，只有戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化這一途徑富集。接下來，DMs通路網絡包括5個相互連接的模塊（圖4G），該網絡中只有一個代謝物在OAT與Sham組和GLJ與OAT組中相反表達。OAT組去甲腎上腺素升高，GLJ-L組降低。GLJ可能通過調節去甲腎上腺素來提高男性生育能力（圖4H）。

圖4 代謝組學和脂質組學實驗鑒定血清中DMs的途徑分析

2.4 大鼠睪丸差異表達基因的鑒定與功能分析

對GLJ處理大鼠與未處理大鼠進行差異表達基因（DEGs）分析，最終鑒定出305個DEGs。將OAT vs. Sham組和GLJ vs. OAT組相反表達的23個DEGs（圖5A-B）輸入STRING進行功能注釋，富集出3條途徑，包括網格蛋白依賴性內吞作用、淋巴細胞遷移的正向調節和內分泌抵抗。這些途徑與免疫和內分泌系統的生物過程有關。然后將GLJ-H和OAT組的DEGs進行功能富集分析，OAT vs Sham組和GLJ-H vs OAT組富集的生物過程（BP）和分子功能（MF），包括生物體發育和免疫過程（圖5C）。GLJ-H組與OAT組中富集的生物過程與神經功能和免疫過程有關（圖5D）。細胞組分和分子功能的富集表明，GLJ-H處理可以調節免疫系統、生物氧化和脂質代謝過程（圖5E）。

圖5 差異表達基因（DEGs）的功能分析

2.5 多組學結果與GLJ潛在靶點的集成網絡分析

根據代謝組學和脂質組學鑒定的GLJ-H和OAT組的DMs和DEGs構建代謝網絡，通過代謝物、DEGs的人類同源物和GLJ靶點構建GLJ基因-代謝物網絡（圖6A）。利用網絡中的基因和代謝物確定了前30條通路，包括內分泌系統、免疫系統和脂質代謝（圖6B）。提取各組DMs及相關基因，構建GLJ基因- DMs網絡，發現PC （22:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)）、花生四烯酸、硫酸雌酮和鞘氨氨酸OAT中與GLJ的治療密切相關（圖6C、D）。接下來，確定了7個靶點評分大于5的關鍵靶點（ESR1、AR、ABCB1、ABCC1、ALB、PLA2G1B、NOS2）為OAT中GLJ的關鍵靶點（圖6E）。進一步，將OAT和GLJ組中7個關鍵靶點和相反表達的23個DEGs輸入STRING中尋找功能關聯，發現8個DEGs （ABCB11、ALDH18A1、CCL3、CD244、CIITA、CYP2C8、DLL1、ITGA4）與7個關鍵靶點連鎖。通過綜合網絡分析，確定了OAT中GLJ的關鍵分子，包括4個關鍵代謝物、7個關鍵靶點和8個關鍵DEGs。最后，構建了9種草藥、71種成分、19種關鍵分子和30種途徑之間相互作用的草藥-成分-關鍵分子通路網絡，主要可分為5類（氨基酸代謝、脂質代謝、神經系統、免疫系統、內分泌系統），其中類固醇激素的生物合成是最重要的（圖6F）。此外，GLJ中作用于類固醇激素生物合成關鍵靶點的8種成分被預測為GLJ治療OAT的潛在活性成分。在19個關鍵靶點中，花生四烯酸是網絡中最突出的代謝物節點。因此，預計花生四烯酸代謝在GLJ治療OAT中具有關鍵作用。

圖6 多組學結果與GLJ潛在靶點的集成網絡分析

2.6GLJ及其成分對T****分泌的影響

GLJ(補骨脂素、異補骨脂素、淫羊藿苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、熊果酸和人參皂苷Ro與OAT的治療密切相關。因此，采用TM3體外實驗對8種化合物和GLJ進行評價，結果表明，GLJ以濃度依賴的方式顯著提高T分泌水平（圖7A-F）。在8種化合物中，補骨脂素對T分泌的影響最大，在5 μM下可顯著促進T分泌。

2.7 AA代謝參與T****分泌

為了研究AA代謝在GLJ治療OAT中的重要性，我們從定量和時間關系的角度研究了AA在T分泌中的作用。10-7 M~10-4 M AA在處理3小時和24小時后顯著促進TM3中T的分泌，但處理3小時和24小時后T的分泌無顯著差異（圖7H - I）。GLJ （80 ng/ml）可促進AA的這種作用， GLJ （80 ng/ml）能顯著增加TM3中T的分泌，而阿司匹林（25 μM，環氧化酶抑制劑）能顯著降低GLJ的促進作用，抑制率為50%（圖7J）。與阿司匹林單獨治療相比，阿司匹林聯合Zileuton （25 μM，脂氧合酶抑制劑）對GLJ刺激的抑制作用相似。

圖7 TM3中T分泌水平的測定

3. 小結

近年來，OAT已成為一個普遍的男性健康問題，男性的精子數量和生存能力明顯下降。GLJ是一種具有百年使用歷史的中草藥方劑，臨床上常用于治療包括OAT在內的一些男性疾病。本研究首次采用綜合網絡藥理學和多組學方法系統闡明了GLJ的作用機制和化合物。GLJ、補骨脂素、異補骨脂素、異甘草素、甘草素和人參皂苷Ro均能顯著提高TM3的T水平。因此，這五種成分可能是GLJ治療OAT的有效成分。此外，花生四烯酸代謝加環氧酶途徑通過促進TM3的T分泌，與GLJ的治療顯著相關。

參考文獻

Zhu R, Gao Z, Wu S, Ma S, Zhu Y, Zhang S, Zhang Y, Zeng H, Ma C, Zhao J, Ye J, Zhang W. Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway. Phytomedicine. 2024 Oct 28;135:156184. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156184. Epub ahead of print. PMID: 39488872.