植物來源藥用天然產物的合成生物學研究進展

摘要

大多數藥用天然產物在植物中含量低微，提取分離困難；而且這些化合物一般結構復雜，化學合成難度大，還容易造成環境污染。基于合成生物學技術獲得藥用天然產物具有綠色環保和可持續發展等優點。文中以藥用萜類化合物人參皂苷、紫杉醇、青蒿素、丹參酮，生物堿類化合物長春新堿、嗎啡以及黃酮類化合物燈盞花素為例，總結了植物來源藥用萜類、生物堿類和黃酮類化合物的生物合成途徑及合成生物學研究進展，介紹了藥用天然產物合成生物學研究的關鍵技術與方法，并展望了合成生物學技術在藥用天然產物研究與開發方面的應用前景。?

植物來源的藥用天然產物通常是植物的次級代謝產物，這些次級代謝產物對維持植物基本生命活動并沒有重要作用，但可以通過與環境的相互作用來提高植物生存和抵抗外界壓力的能力[1]。植物次級代謝產物是動植物之間許多生態相互作用的基礎[2]，例如，某些萜類化合物可以充當化感物質吸引傳粉動物、驅趕食草動物或誘惑食草動物的捕獵者[3-4]。植物之所以能夠產生次級代謝產物與其進化過程有關[1,?5]。

植物中具有生物活性的次級代謝產物在藥品及保健品領域應用廣泛，在香水、農藥、化妝品行業也具有重要價值[6]。目前投入臨床使用的植物次級代謝產物有抗瘧藥青蒿素、鎮痛藥嗎啡、抗腫瘤藥紫杉醇及治療心腦血管疾病的藥物丹參酮等，它們的藥理作用廣泛、藥效好，臨床需求量極大，因此受到了越來越多的關注[7-8]。目前植物來源的藥用天然產物主要是通過直接從植物中提取分離獲得，但大量栽培藥用植物會占用耕地，且有些藥用植物具有生長周期長和連作障礙等問題，而且這些天然產物在植物中通常含量較低，提取步驟煩瑣，收率低，因此需要開發新的方法生產這些藥用天然產物來滿足人們日益增長的需求。這些新的生產方法包括化學合成、化學半合成、從植物組織細胞培養中提取和利用微生物細胞工廠異源生產等。大多數天然產物結構復雜，有些具有手性中心，這給化學全合成帶來了很大的挑戰。雖然部分藥用天然產物已經實現化學全合成，但通常由于過程復雜、產率低和成本太高，而不能投入商業生產，而且通過化學方法合成天然產物也會帶來環境污染。化學半合成方法是指從植物中提取產量較多的前體化合物，再結合化學合成方法獲得天然產物，這也是目前部分植物源藥物供應的重要方法。從植物組織細胞培養中提取也是植物來源藥物重要的獲取方式。迄今為止，已有多種植物組織培養系統被報道，包括愈傷組織、懸浮細胞、不定根和毛狀根等，但組織細胞培養生產周期長、操作步驟復雜、成本過高，也不利于擴大生產。目前，科研人員也通過調控植物的次級代謝產物合成途徑來提高產量，但是植物代謝途徑調控的難度遠大于微生物[9]。隨著基因組學和蛋白質組學的發展，藥用天然產物生物合成途徑逐漸被解析，通過合成生物學方法，即利用微生物細胞工廠異源生產天然藥物已成為研究熱點。微生物繁殖速度快，生長周期短，發酵工藝成熟，且產物易于提取分離，生產成本低，因此通過微生物細胞工廠生產藥物被認為是解決藥物稀缺問題的可行方法。本文總結了植物來源的藥用萜類化合物(人參皂苷、紫杉醇、青蒿素、丹參酮)、生物堿類化合物(長春新堿、嗎啡) 及黃酮類化合物(燈盞花素) 的生物合成途徑及合成生物學研究進展，介紹了藥用植物次級代謝產物合成生物學研究策略，對通過合成生物學技術生產天然藥物具有重要的指導意義。

1 萜類化合物生物合成

植物次級代謝產物生物合成的起始部分通常是莽草酸途徑、糖酵解途徑、甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA) 途徑等，隨后經過各自特定的步驟產生獨特的產物。萜類化合物的生物合成通常經歷3個階段：(1) 異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP) 及其異構體二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP) 的生成；(2) 萜類化合物前體牻牛兒基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP) 和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)等的生成；(3) 萜類合酶環化及CYP450酶等的修飾。在植物中，有兩條途徑可以生成IPP和DMAPP，分別是存在于細胞質中的MVA途徑和存在于質體中的甲基-赤蘚醇-4-磷酸(Methylerythritol phosphate，MEP) 途徑[10]。MVA途徑中的關鍵酶是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy- 3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)，MEP途徑的關鍵酶是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS) 和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR)。不同數目的IPP和一分子DMAPP在異戊烯基轉移酶的催化下形成萜類化合物的前體GPP、FPP和GGPP。其中，牻牛兒基焦磷酸合酶(Geranyl diphosphate synthase，GPPS) 催化一分子IPP和一分子DMAPP形成GPP，作為單萜的前體；兩分子IPP和一分子DMAPP在法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，FPPS)的催化下生成FPP，作為倍半萜和三萜前體；牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS) 催化三分子IPP和一分子DMAPP生成GGPP，作為二萜和四萜的前體(圖 1)[11]。GPP、FPP和GGPP通過不同的萜類合酶的催化及細胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenase，CYP450) 的修飾形成多種多樣的萜類化合物[12]。本文對幾類重要的植物來源的藥用萜類化合物的生物合成途徑及合成生物學研究進展進行了綜述。

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1.1 人參皂苷

人參皂苷是我國傳統名貴藥材人參Panax ginseng的主要活性成分，它具有廣泛的藥理活性，在調節免疫力、抗疲勞、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等方面具有顯著的功效[13]。人參皂苷作為藥物和保健品深受人們喜愛，市場需求極大，但人參資源稀少，生長周期長(5-7年)，人工栽培具有連作障礙，且人參皂苷在人參中的含量較低[14]，導致其供應量遠遠不能滿足人們的需求。

人參皂苷屬于三萜化合物，其生物合成途徑已被解析。以FPP作為直接前體，鯊烯合酶(Squalene synthase，ERG9) 催化兩分子的FPP形成鯊烯(Squalene)，然后被鯊烯環氧酶(Squalene epoxidase，ERG1) 催化生成2, 3-氧化鯊烯(2, 3-oxidosqualene)，2, 3-氧化鯊烯在β-香樹脂合酶(β-amyrin synthase，β-AS) 和達瑪烯二醇-Ⅱ合酶(Dammarenediol-Ⅱ synthase，DS) 的催化下，分別形成五環三萜β-香樹脂(β-amyrin) 和四環三萜達瑪烯二醇-Ⅱ (Dammarenediol-Ⅱ，DM)。β-香樹脂經齊墩果酸合酶(Oleanolic acid synthase，OAS) 催化生成齊墩果酸(Oleanolic acid)，隨后經過糖基轉移酶的催化生成相應的齊墩果烷型糖苷；DM依次經過原人參二醇合酶(Protopanaxadiol synthase，PPDS) 和原人參三醇合酶(Protopanaxatriol synthase，PPTS) 的催化生成原人參二醇(Protopanaxadiol，PPD)和原人參三醇(Protopanaxatriol，PPT)，隨后經過UDP-糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT) 的催化形成相應的達瑪烷型人參皂苷。PPD型皂苷有Rbl、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2等，PPT型皂苷有Re、Rgl、Rg2、Rf、Rhl等(圖 2)[15]。

酵母細胞能夠產生人參皂苷的關鍵前體2, 3-氧化鯊烯，這為利用酵母細胞異源生產人參皂苷提供了便利。Dai等在釀酒酵母中引入人參來源的DS、PPDS和擬南芥來源的CYP450還原酶(Cytochrome P450 reductase，CPR) 生產PPD，通過過表達關鍵酶(tHMGR、FPPS、ERG9等) 提高2, 3-氧化鯊烯前體供應，并對PPDS進行密碼子優化以促進其表達，利用兩相發酵技術使工程菌中PPD的產量達到1 189 mg/L，同時DM產量達到1 548 mg/L[16]。Dai等通過在釀酒酵母中轉入PPD、PPT和齊墩果酸合成所需基因并過表達關鍵酶，構建的工程菌中PPD、PPT和齊墩果酸的產量分別為17.2 mg/L、15.9 mg/L和21.4 mg/L[17]。在催化過程中，CYP450酶及CYP450還原酶會因低耦合而產生一種代謝副產物活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，對細胞產生毒性作用，從而影響宿主細胞的正常生長[18-19]。Zhao等通過表達與細胞壁完整性相關的基因SSD1提高了細胞對乙醇的耐受性，且通過調節氧化應激調節基因YBP1的表達降低了ROS的水平，使釀酒酵母工程菌中PPD的產量提高至4.25 g/L[20]。Wang等從人參中克隆并鑒定了兩種UDP依賴性的糖基轉移酶UGTPg45和UGTPg29，前者使PPD的C3位糖基化生成稀有人參皂苷Rh2，后者可以延長Rh2的糖鏈而產生稀有人參皂苷Rg3，將兩種糖基轉移酶引入產PPD的底盤細胞中實現了Rh2和Rg3在釀酒酵母中的合成，產量分別為0.90 mg/g和2.74 mg/g[21]。Zhuang等發現釀酒酵母來源的糖基轉移酶UGT51具有雜泛性，可以催化PPD的C3位糖基化生成Rh2，通過對UGT51的關鍵氨基酸進行突變以提高其催化活性，同時，通過敲除糖基水解酶EGH1基因以減少Rh2的水解，提高糖基供體UDP-葡萄糖(UDPG) 的供應等方法對工程菌進行優化，在5 L發酵罐中Rh2的產量達到300 mg/L[22]。Wang等通過模塊化工程，將PPD生物合成基因分為兩個模塊，包括上游途徑模塊(ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI和tHMGR) 和下游模塊(ERG1、ERG20、ERG9、DS、PPDS和PgCPR1)，將這13個基因進行過表達，構建了高產PPD的釀酒酵母工程菌，使10 L發酵罐中PPD產量達到11.02 g/L。利用上述底盤細胞，構建了產Rh2的工程菌，通過優化啟動子、提高基因拷貝數以及對C3位糖基轉移酶進行蛋白質工程改造等策略，使工程菌中Rh2的產量達到2.25 g/L[23]。Yan等鑒定了可以催化PPD的C20位糖基化生成Compound K (CK) 的糖基轉移酶UGTPg1，并將CK生物合成所需基因轉入釀酒酵母，通過優化啟動子、過表達tHMGR和轉錄因子UPC2-1，使CK的產量達到1.4 mg/L[24]。Li等將CK的生物合成基因引入解脂耶氏酵母中，并通過過表達MVA途徑關鍵酶ERG1、ERG8、ERG9、ERG10和tHMGR等，融合表達PPDS及其還原酶，通過補料分批發酵在5 L發酵罐中使CK產量達到161.8 mg/L[25]。Wang等構建了產PPD的釀酒酵母工程菌，其中過表達了MVA途徑基因、FPP合酶基因、鯊烯合酶基因、2, 3-氧化角鯊烯合酶基因以及SynPgDDS基因、SynPgPPDS基因和來源于葡萄Vitis vinifera的CPR基因，在此基礎上，將三七糖基轉移酶Pn3-29和UDPG合成途徑關鍵酶PGM1、PGM2和UGP1整合入酵母基因組中的LPP1位點，構建了產CK的酵母工程菌，又通過高拷貝質粒提高Pn3-29的拷貝數，最終通過高密度發酵在5 L發酵罐中使CK的產量達到1.17 g/L[26]。Wei等發現UGTPg1不僅能催化PPD的C20位羥基糖基化，還可以催化PPT的C20位羥基糖基化生成人參皂苷F1，并證明了UGTPg100可以使PPT的C6位羥基糖基化生成人參皂苷Rh1；他們將PPT生物合成相關基因以及UGTPg1或UGTPg100引入酵母細胞，實現了PPT型人參皂苷F1和Rh1在釀酒酵母中的從頭合成[27]。Liang等鑒定了枯草芽孢桿菌的一種糖基轉移酶UGT109A1，該酶可以催化DM、PPD、PPT分別生成非天然人參皂苷3β-O-Glc-DM、3β, 20S-Di-O-Glc-DM、3β, 12β-Di-O-Glc-PPD和3β, 12β-Di-O-Glc-PPT。通過在釀酒酵母中引入具有抗肺癌活性的3β, 12β-Di-O-Glc-PPD生物合成所需基因并過表達關鍵酶tHMGR，使工程菌中3β, 12β-Di-O-Glc-PPD的產量達到9.05 mg/L[28]。Hu等利用人參來源的糖基轉移酶PgUGT74AE2和UGTPg1催化DM的C3位和C20位糖基化，生成了具有抗結腸癌活性的非天然人參皂苷3β-O-Glc-DM和20S-O-Glc-DM，并在釀酒酵母中實現了這兩種皂苷的從頭合成；進一步通過底盤細胞優化、CRISPR/Cas9技術實現外源基因多拷貝整合、過表達上游關鍵酶及補料分批發酵等方法對工程菌進行優化，最終使3β-O-Glc-DM和20S-O-Glc-DM在3 L發酵罐中的產量分別達到2.4 g/L和5.6 g/L[29]。

1.2 紫杉醇

紫杉醇(Paclitaxel，Taxol?) 是一種二萜類化合物，最早于1967年從太平洋紅豆杉Taxus brevifolia樹干中分離得到[11]，具有抗腫瘤、抗瘢痕形成、抗血管生成等多種藥理活性，目前臨床主要用于治療卵巢癌和乳腺癌[30]。1979年首次發現紫杉醇的抗腫瘤作用機制，它通過穩定微管的形成，使細胞周期阻滯在G2/M期，最終導致腫瘤細胞凋亡[31]。紫杉醇臨床需求極大，但紅豆杉中紫杉醇的含量極低，供應嚴重不足[32]。1994年，兩個實驗室采用不同的方法幾乎同時報道完成了紫杉醇的化學全合成，但是由于其合成過程復雜且產率極低，無法擴大生產[33-36]。當前臨床使用的紫杉醇主要通過原植物提取和利用前體化合物——巴卡亭Ⅲ (Baccatin Ⅲ) 或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ (10-deacetylbaccatin Ⅲ) 化學半合成的方法獲得[11]。

目前紫杉醇的部分生物合成途徑已經被解析，其生物合成過程的第一步是GGPP由紫杉烯合酶(Taxadiene synthase，TS) 催化環化為紫杉烯(Taxa-4, 11-diene)，TS是紫杉醇合成途徑中的第一個關鍵酶。隨后，CYP450酶紫杉烯5α羥化酶(Taxadiene-5α-hydroxylase，T5αH) 催化紫杉烯5位羥基化生成Taxadiene-5α-ol，催化產物可經過紫杉烯醇-5α-乙酰氧基轉移酶(Taxadiene- 5α-ol-O-acetyl transferase，TDAT) 和紫杉烯13α羥化酶(Taxadiene-13α-hydroxylase，T13αH) 的催化分別生成Taxadiene-5α-yl-acetate和Taxadiene- 5α-13α-diol。前者經紫杉烯10β羥化酶(Taxadiene- 10β-hydroxylase，T10βH) 的催化生成Taxadiene- 5α-yl-acetate-10β-ol，隨后在一系列羥化酶及氧化酶的作用下生成推測的前體2-去苯甲酰紫杉烷(2-debenzoyltaxane)，而這些酶尚未被完全鑒定。接著紫杉烷2α-O-苯甲酰基轉移酶(Taxane 2α-O-benzoyltransferse，TBT) 催化2-debenzoyltaxane生成10-去乙酰巴卡亭Ⅲ，隨后經10-去乙酰巴卡亭Ⅲ 10-O-乙酰轉移酶(10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-?O-acetyltransferse，DBAT) 催化生成巴卡亭Ⅲ，再由巴卡亭Ⅲ-13-O-苯基丙酰基轉移酶(Baccatin Ⅲ- 13-O-phenylpropanoyl transferase，BAPT) 催化，在其13位添加側鏈，形成β-phenylalanoyl baccatin Ⅲ。其中13位側鏈的合成過程為：α-苯丙氨酸(α-phenylalanine) 經苯丙氨酸氨基變位酶(Phenylalanine aminomutase，PAM) 催化形成β-苯丙氨酸(β-phenylalanine)，β-苯丙氨酸被一未鑒定的酶催化形成β-苯丙氨酸輔酶A (β-phenylalanine CoA)。合成的側鏈在BAPT的作用下連接至巴卡亭Ⅲ的13位上。隨后，β-phenylalanoyl baccatin Ⅲ經一未知的CYP450羥化酶催化，將其13位側鏈的C2位羥基化，再經過3′-N-脫苯甲酰基-2′-脫氧紫杉醇-N-苯甲酰基轉移酶(3′-N-debenzoyl-2′- deoxytaxol-N-benzoyl transferase，DBTNBT) 催化生成紫杉醇(圖 3)[37-38]。

Huang等在大腸桿菌中過表達IPP異構酶(Isoprenyl diphosphate isomerase，IDI) 和GGPPS，同時表達TS，實現了紫杉烯在大腸桿菌中的生物合成，產量為1.3 mg/L[39]。Ajikumar等應用一種代謝途徑工程的多元模塊化方法，將紫杉烯生物合成途徑分為兩部分：一部分是天然的MEP途徑形成IPP和DMAPP；另一部分是下游的萜類合成途徑。通過優化平衡兩個模塊，成功地將工程化大腸桿菌中的紫杉烯產量提高了15 000倍，約1 g/L[40]。Biggs等在大腸桿菌表達氧化紫杉烯合成所需要的基因，通過調整質粒拷貝數及啟動子優化CYP450酶的表達，對CPR進行優化以及對膜結合蛋白的N末端進行修飾以提高蛋白表達及可溶性，在2 L發酵罐中工程化大腸桿菌中氧化紫杉烯的產量達到570 mg/L[41]。紫杉醇生物合成途徑中涉及多個CYP450酶，真核生物酵母更適合表達膜結合蛋白，為紫杉醇及其中間體的異源生產提供了便利[42]。Engels等在釀酒酵母中引入紫杉烯合成相關基因，并過表達關鍵酶tHMGR、TS、GGPPS及轉錄因子UPC2-1，抑制支路基因，表達嗜酸硫桿菌來源的GGPPS，并對TS進行密碼子優化，最終獲得的釀酒酵母工程菌中紫杉烯產量達到8.7 mg/L。同時紫杉烯前體牻牛兒基牻牛兒醇產量達33.1 mg/L，這也暗示可能可以通過促進前體轉化，使紫杉烯的產量進一步提高[43]。Reider等利用CRISPR/Cas9技術建立了一種無克隆的工具盒，可以解決代謝工程中的一些常見問題，比如選擇染色體整合位點和啟動子，加入蛋白定位、改善穩定性和溶解度的標簽等。將該工具盒應用于產紫杉烯工程菌的構建，探索了多種蛋白標簽及啟動子對TS在釀酒酵母中表達的影響，最終使工程菌中紫杉烯產量達到20 mg/L[44]。Ding等在釀酒酵母中過表達基因ERG20和tHMGR，并引入TS基因，構建了紫杉烯生物合成途徑。通過酶-底物分子對接策略分析了6種不同來源的GGPPS與FPP的結合能力，其中南方紅豆杉和東北紅豆杉雜交種來源的GGPPS在對接分析及體內驗證都表現出了最高的活性，最終使工程菌中紫杉烯產量達到72.8 mg/L[45]。紅豆杉中7-β-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol，XDT) 及其類似物的含量較高，它可以被生物轉化為10-去乙酰紫杉醇(10-deacetyltaxol，DT) 用于紫杉醇的半合成。Cheng等從真菌香菇Lentinula edodes中克隆到一個糖基水解酶LXYL-P1-2，可以水解XDT的木糖基使其轉化為DT[46]。Yu等利用轉入LXYL-P1-2的畢赤酵母工程菌將XDT轉化為DT，轉化率達到80%[47]。Liu等通過對反應體系中上述工程菌的量、DMSO的濃度和底物的濃度進行優化，使XDT到DT的轉化率提高到93%-95%，同時建立了一種大量純化產物的方法[48]。Chen等通過蛋白質工程手段進一步提高了該糖基水解酶的活性，并通過共表達透明顫菌血紅蛋白VHB和分子伴侶蛋白質二硫鍵異構酶PDI，提高突變體在畢赤酵母中的表達水平，獲得的酵母工程菌可以用于XDT的高效生物催化和紫杉醇半合成[49]。Li等通過丙氨酸掃描、半飽和突變和組合突變的方法獲得雙突變體DBATG38R/F301V，提高了DBAT對DT的催化效率，并結合LXYL-P1-2，成功構建了從XDT到紫杉醇轉化的雙酶催化一鍋法反應體系，15 h時50 mL體系中紫杉醇產量達到0.64 mg/mL[50]。目前對于利用微生物異源生產紫杉醇還停留在前體的生成階段，在微生物中從頭全合成紫杉醇的研究還依賴于其生物合成途徑的進一步解析。

1.3 青蒿素

青蒿素(Artemisinin) 是從草本植物黃花蒿Artemisia annua中提取到的倍半萜類化合物，具有顯著的抗瘧疾活性。在過去的10多年里，以青蒿素為基礎的綜合療法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs) 降低了全球瘧疾的發病率和死亡率，對于青蒿素及其衍生物的研究在國際上掀起了熱潮[51]。青蒿素的生物合成途徑已經基本解析清楚。作為一種倍半萜類化合物，青蒿素的生物合成屬于類異戊二烯途徑，FPP是主要的前體化合物。紫穗槐二烯合酶(Amorpha- 4, 11-diene synthase，ADS) 催化FPP環化生成紫穗槐二烯(Amorphadiene)，隨后，紫穗槐二烯經過三步氧化逐次生成青蒿醇(Artemisinic alcohol)、青蒿醛(Artemisinic aldehyde)、青蒿酸(Artemisinic acid)，該步驟由單一的CYP450酶(CYP71AV1)催化完成。目前，商業上以青蒿酸為前體，化學半合成青蒿素來滿足市場供應。而天然的青蒿素生物合成是在形成青蒿醛后，被關鍵酶青蒿醛還原酶(Artemisinic aldehyde reductase，DBR2) 催化，生成雙氫青蒿醛(Dihydroartemisinic aldehyde)，再由醛脫氫酶(Artemisinic aldehyde dehydrogenase，ALDH1) 催化，生成青蒿素的直接前體雙氫青蒿酸(Dihydroartemisinic acid)，最后經過一步非酶促的光氧化步驟生成青蒿素。青蒿酸經過光氧化最終生成青蒿素B (圖 4)[52]。

ATCs療法價格昂貴，全球對于青蒿素的需求量極大，僅僅依賴從植物中提取不能滿足需求。Ro等通過在釀酒酵母中引入ADS、CYP71AV1等青蒿酸生物合成基因，實現了青蒿酸在釀酒酵母中的合成；通過上調MVA途徑的基因tHMGR、ERG20、ERG12、ERG8等，使青蒿酸產量提高至100 mg/L；青蒿酸在酵母體內合成后被轉運至體外，簡化了其純化步驟[53]。Westfall等在釀酒酵母中過表達了MVA途徑的每個基因，與Ro等的結果相比，青蒿酸的產量提高了2倍，紫穗槐二烯的產量提高了10倍。通過對釀酒酵母發酵過程進行優化，包括降低磷酸鹽濃度、使用葡萄糖/乙醇混合碳源飼喂等方法，最終使工程菌中青蒿素前體紫穗槐二烯的產量達到40 g/L。同時，該研究探索了紫穗槐二烯化學轉化為雙氫青蒿酸的方法，雙氫青蒿酸可以進一步轉化為青蒿素[54]。Paddon等鑒定了兩種參與青蒿酸生物合成的酶——植物脫氫酶和細胞色素CYB5，將它們引入產青蒿酸的釀酒酵母中，并且過表達MVA途徑相關基因，下調支路途徑中ERG9的表達，提高了工程菌中青蒿酸的產量。在此基礎上，通過在培養基中加入肉豆蔻酸異丙酯，采用兩相發酵，最終使青蒿酸產量達到25 g/L。此外，他們還設計了一種經濟高效的化學方法將青蒿酸轉化成青蒿素，以此來生產青蒿素，最終總收率達到40%-50%，且純度高于植物中提取的青蒿素。該方法在一定程度上可以穩定青蒿素的供應，具有重要的應用價值[55]。

1.4 丹參酮

丹參酮(Tanshinones) 是一類松香烷二萜化合物，來源于傳統中藥材丹參Salvia miltiorrhiza，主要存在于丹參的根莖中。丹參酮是丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮等一類化合物的總稱，目前臨床上主要用于治療心血管疾病。另外，丹參酮還具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺氧等藥理活性[56-58]。目前丹參酮主要從植物丹參中提取，但丹參生長周期長，丹參酮提取步驟復雜，因而影響了對它的進一步開發[59]。

與其他萜類化合物一樣，丹參酮的前體IPP和DMAPP來源于兩條代謝途徑，即MVA途徑和MEP途徑，其中MEP途徑被認為是丹參酮C5前體的主要來源[60]。二萜合酶一般為雙功能酶，如紫杉醇生物合成途徑中的紫杉烯合酶，可以將GGPP直接催化為二萜烯，即紫杉烯。而丹參酮的前體GGPP先經科巴基焦磷酸合酶(Copalyl diphosphate synthase，CPS) 的催化生成科巴基焦磷酸(Copalyl diphosphate，CPP)，然后CPP在類貝殼杉烯合酶(Kaurene synthase-like，KSL) 的催化下生成次丹參酮二烯(Miltiradiene)，需要經過兩步反應。次丹參酮二烯后續再經過雜環化、芳香化、去甲基化等形成相應的丹參酮類化合物。CYP76AH1是丹參酮生物合成下游途徑中一個非常重要的酶，催化次丹參酮二烯生成鐵銹醇(Ferruginol)。Guo等鑒定了兩個參與丹參酮生物合成的CYP450酶CYP76AH3和CYP76AK1，兩者均具有一定的底物寬泛性。其中，CYP76AH3催化鐵銹醇生成11-羥基鐵銹醇(11-hydroxy ferruginol)、柳杉酚(Sugiol) 和11-羥基柳杉酚(11-hydroxy sugiol)，CYP76AK1催化11-羥基鐵銹醇和11-羥基柳杉酚生成11, 20-二羥基鐵銹醇(11, 20-dihydroxy ferruginol) 和11, 20-二羥基柳杉酚(11, 20-dihydroxy sugiol)，隨后經過未知酶的催化生成丹參酮類化合物(圖 5)[61]。

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Zhou等通過使用模塊化途徑工程(Modular pathway engineering，MOPE) 方法在釀酒酵母中組裝了次丹參酮二烯的合成途徑，并預測和分析了CPS和KSL之間的分子相互作用，構建了CPS和KSL融合蛋白，使它們的活性位點緊密相鄰，同時將GGPPS和ERG20融合，最終使次丹參酮二烯產量提高至365 mg/L[62]。Dai等過表達FPPS和內源性GGPPS的融合蛋白以及來源于嗜酸硫桿菌的異源GGPPS基因，增加流向FPP和GGPP的碳流量，同時過表達基因tHMGR-UPC2.1，再通過補料分批培養使次丹參酮二烯的產量提高至488 mg/L[63]。Hu等通過構建高產GGPP的底盤細胞，篩選并利用來源于毛喉鞘蕊花的基因CfTPS1和來源于丹參的基因SmKSL1以提高次丹參酮二烯的產量，又通過融合CfTPS1和SmKSL1及蛋白截短的蛋白質工程策略進一步提高了次丹參酮二烯的產量，最終其搖瓶水平產量達到550.7 mg/L，5 L發酵罐水平產量達到3.5 g/L[64]。Guo等鑒定了次丹參酮二烯轉化為鐵銹醇所需的酶CYP76AH1，并利用釀酒酵母異源表達丹參酮生物合成途徑中所需要的酶，構建了產鐵銹醇的酵母工程菌，產量為10.5 mg/L[65]。隨后，他們又鑒定了兩個CYP450酶CYP76AH3和CYP76AK1，并實現了其在釀酒酵母中的異源表達，獲得了相應的氧化丹參酮中間體[61]。目前為止，后續丹參酮生物合成過程中涉及的基因還未被鑒定，據推測可能涉及CYP450酶、脫氫酶及其他酶[66]。只有完成對丹參酮生物合成途徑的完全解析，才能通過合成生物學技術實現丹參酮的大量生產。

2 生物堿類化合物生物合成

生物堿類化合物在自然界中廣泛存在，是一類含氮的堿性有機物。目前已知的生物堿約有12 000種[67]，按照結構可以分為有機胺類生物堿、異喹啉類生物堿、吡啶類生物堿、吲哚類生物堿和莨菪烷類生物堿等。生物堿的化學結構復雜多樣，用于醫藥領域已經有上千年的歷史，但是對于生物堿類化合物的生物合成、調節和轉運的了解相對較少[68]。目前對于抗腫瘤藥長春新堿(Vincristine) (吲哚類生物堿) 及鎮痛藥嗎啡(Morphine) (異喹啉類生物堿) 生物合成途徑的研究有了一定的進展，基于合成生物學在微生物中合成這兩類生物堿的技術也得到了廣泛的研究。

2.1 長春新堿

藥用、觀賞植物長春花Catharanthus roseus可以產生大量次級代謝產物，大多屬于萜類生物堿。迄今為止，已經從長春花中分離和鑒定了130多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)，主要包括單萜類阿瑪堿、文多靈(Vindoline)，二氫吲哚類的長春質堿(Catharanthine)、蛇根堿以及二萜類長春堿(Vinblastine)、長春新堿等[69-71]。其中長春新堿是著名的抗腫瘤藥物，臨床上用于治療惡性淋巴瘤、何杰金氏病、急性淋巴細胞性白血病等；阿瑪堿和蛇根堿具有降血壓及抗神經性炎癥的作用[70-72]。長春新堿在長春花中的含量非常低，商業化生產通常使用含量較高的長春質堿和文多靈進行化學半合成。長春花生物堿藥用價值大，但在植物中含量較低，生產成本高，這促進了科學家們對長春花中TIAs合成的基本途徑和調控機制的研究。

TIAs的生物合成途徑分為上游和下游兩個階段。上游階段有兩條途徑，分別是莽草酸途徑(又稱為吲哚途徑) 和類甲羥戊酸途徑(又稱類萜途徑)。前者經過一系列酶促反應生成色氨酸，然后經過色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC) 的催化生成色胺(Tryptamine)；后者產生的GPP在多步酶催化后產生裂環馬錢子苷(Secologanin)。色胺和裂環馬錢子苷再由異胡豆苷合酶(Strictosidine synthase，STR) 催化縮合產生異胡豆苷(Strictosidine)。STR是TIAs生物合成過程中的第一個非常關鍵的酶。下游階段則以異胡豆苷為底物，經過不同的酶催化生成相應的終產物。

異胡豆苷經異胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(Strictosidine-β-D-glucosidase，SGD) 催化生成異胡豆苷苷元(Strictosidine aglycone)，異胡豆苷苷元可自發生成4, 21-脫氫縫籽木榛(4, 21-dehydrogeissoschizine)，然后經縫籽木榛合酶(Geissoschizine synthase，GS) 催化后生成縫籽木榛(19E-geissoschizine)，催化產物經過多步氧化還原催化生成花冠木堿(Stemmadenine)，隨后經花冠木堿-O-酰基轉移酶(Stemmadenine?O-acetyltransferase，SAT) 催化生成O-乙酰基花冠木堿(O-acetylstemmadenine)，在O-乙酰基花冠木堿氧化酶(O-acetylstemmadenine oxidase，ASO)、GS、長春質堿合酶(Catharanthine synthase，CS) 及水甘草堿合酶(Tabersonine synthase，TabS) 的催化下分別生成長春質堿和水甘草堿(Tabersonine)[73]。Caputi等證明Precondylocarpine acetate synthase (PAS) 和Dihydroprecondylocarpine synthase (DPAS) 兩個酶也參與了異胡豆苷合成長春質堿及水甘草堿的過程，其中前者與ASO一致，后者屬于一種不同的類肉桂醇脫氫酶[74]。文多靈的生物合成途徑如下：異胡豆苷通過一系列反應生成水甘草堿，隨后被其羥化酶(Tabersonine 16-hydroxylase，T16H) 催化生成16-羥基水甘草堿(16-hydroxytabersonine)，然后在16-O-甲基轉移酶(16-O-methyhransferase，16OMT) 的作用下生成16-甲氧基水甘草堿，16-甲氧基水甘草堿在水甘草堿-3-氧化酶(Tabersonine-3-oxygenase，T3O) 和水甘草堿-3-還原酶(Tabersonine-3-reductase，T3R) 的共同作用下生成16-甲氧基-2, 3-二氫-3-羥基水甘草堿(16-methoxy-2, 3-dihydro-3-hydroxytabersonine)，隨后經過N-甲基轉移酶(N-methyhransferase，NMT)、去乙酰氧基文多靈羥化酶(Deacetoxyvindoline-4-hydroxylase，D4H) 和去乙酰文多靈-4-O-乙酰轉移酶(Deacetylvindoline- 4-O-acetyhransferase，DAT) 的催化，依次生成去乙酰氧基文多靈、乙酰文多靈及終產物文多靈[75]。單萜類生物堿長春質堿和文多靈經過過氧化物酶α-3', 4'-脫水長春堿合酶(Peroxidase?α-3′, 4′-anhydrovinblastine synthase，PRX1) 的催化縮合生成3′, 4′-脫水長春堿(3′, 4′-anhydrovinblastine，AVLB)[76]，隨后經過未知酶的催化依次生成長春堿和長春新堿(圖 6)。

Geerlings等將長春花STR和SGD基因轉入釀酒酵母中，加入外源的色胺和裂環馬錢子苷后，首次實現異胡豆苷和Cathenamine在釀酒酵母中的合成，異胡豆苷大部分存在于培養基中，其產量為2 g/L，Cathenamine的產生量則較少(< 10 μg/g濕重)[77]。Brown等實現了異胡豆苷在釀酒酵母體內的從頭合成，通過敲除旁路代謝的3個基因ERG20、ATF1和OYE2，表達15種植物來源的基因(AgGPPS2、GES、G8H、GOR、ISY、IO、7-DLGT、7-DLH、LAMT、SLS、TDC、STR、CYB5、CPR和CYPADH)、1個動物來源的基因(禽類FPPS：mFPSN144W) 和過表達酵母自身的5個基因(tHMGR、MAF1、IDI1、SAM2和ZWF1)，最終使工程菌中異胡豆苷產量達到0.5 mg/L，這為TIAs在釀酒酵母中的合成奠定了基礎[78]。Campbell等綜合一系列策略優化了TIAs生物合成的前期步驟，包括過表達釀酒酵母MVA途徑相關基因以及植物來源的合成荊芥內酯的基因(GES、G10H、CPR等)，突變ERG20基因以減少向FPP的流量等，使工程菌中異胡豆苷前體牻牛兒醇的產量達到11.4 mg/L[79]。Qu等鑒定了T3O和T3R，并且將水甘草堿合成文多靈所需的7個酶在釀酒酵母中異源表達，實現了文多靈在酵母中的異源合成[80]。

2.2 嗎啡

嗎啡屬于芐基異喹啉類生物堿(Benzylisoquinoline alkaloids，BIAs)，來自罌粟科植物罌粟Papaver somniferum，是用于治療中、重度和慢性疼痛最有效的麻醉鎮痛藥[81]。目前，對嗎啡等阿片類生物堿的需求量極大，每年需要種植約100 000 hm2的罌粟，生產800 t以上的阿片類化合物(主要是嗎啡和蒂巴因) 才能滿足合法的醫療和科研需求[82]。

嗎啡的生物合成是從L-酪氨酸衍生物多巴胺(Dopamine) 和4-羥苯乙酯(4-hydroxyphenylaceta1dehyde，4-HPAA) 起始，二者由去甲烏藥堿合酶(S-norcoclaurine synthase，NCS) 催化縮合生成(S)-去甲烏藥堿(S-norcolaurine)。隨后(S)-去甲烏藥堿依次被去甲烏藥堿6-O-甲基轉移酶(Norcoclaurine 6-O-methyltransferase，6OMT)、烏藥堿N-甲基轉移酶(Coclaurine?N-methyltransferase，CNMT)、N-甲基烏藥堿羥化酶(N-methylcoclaurine hydroxylase，NMCH)、3′-羥基-N-甲基烏藥堿-4′-O-甲基轉移酶(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O-methyltransferase，4′OMT) 催化生成(S)-烏藥堿(S-coclaurine)、(S)-N-去甲烏藥堿(S-N-methlcolaurine)、(S)-3′-羥基-N-甲基烏藥堿(S-3′-hydroxy-N-methlcolaurine)、(S)-牛心果堿(S-reticuline)。(S)-牛心果堿不能被后續的酶識別，而是需要異構化為(R)-牛心果堿(R-reticuline)，該反應首先由脫氫牛心果堿合酶(1, 2-dehydroreticuline synthase，DRS) 催化(S)-牛心果堿生成1, 2-脫氫牛心果堿，隨后被脫氫牛心果堿還原酶(1, 2-dehydroreticuline reductase，DRR) 催化生成(R)-牛心果堿。DRS和DRR屬于一種P450氧化還原融合蛋白[83]。(R)-牛心果堿被沙羅泰里啶合酶(Salutaridine synthase，SalSyn)催化生成沙羅泰里啶(Salutaridine)，再由沙羅泰里啶還原酶(Salutaridine reductase，SalR) 催化生成氫化沙羅泰里啶，催化產物隨后被沙羅泰里啶乙酰基轉移酶(Salutaridinol 7-O-acetyltransferase，SalAT) 催化，生成氫化沙羅泰里啶-7-O-乙酸(Salutaridinol-7-O-acetate)。氫化沙羅泰里啶-7-O-乙酸經過自發反應脫去乙酰氧基生成蒂巴因(Thebaine)。蒂巴因是植物中可待因和嗎啡生物合成的前體，也是止痛藥羥考酮、丁丙諾啡化學合成的前體。由蒂巴因轉化為嗎啡有兩條途徑：第一條是蒂巴因被可待因-O-脫甲基酶(Codeine-O-demethylase，CODM) 催化生成奧派文(Oripavine)，再由蒂巴因-6-O-甲基轉移酶(Thebaine 6-O-demethylase，T6ODM) 催化生成新嗎啡酮(Neomorphinone)[84]，新嗎啡酮在尼奧平酮異構酶(Neopinone isomerase，NISO) 的催化下生成嗎啡酮(Morphinone)，嗎啡酮在可待因還原酶(Codeinone reductase，COR) 的催化下生成嗎啡，該步驟為NADPH依賴性的可逆反應；第二條途徑是主要途徑，蒂巴因在T6ODM的催化下生成尼奧平酮(Neopinone)，隨后由NISO催化生成可待因酮(Codeinone)，再由COR和CODM催化依次生成可待因(Codeine) 和嗎啡(圖 7)。尼奧平酮異構化為可待因酮及新嗎啡酮異構化為嗎啡酮的步驟在之前一直被認為是自發反應，直到2019年，Dastmalchi等發現該過程實際上是由NISO催化而發生的[85]。

目前主要通過從植物中提取嗎啡類生物堿來滿足需求，也正在開發其他的微生物生產系統來生產嗎啡及其他BIAs。牛心果堿是BIAs生物合成的重要中間體。Hawkins等在釀酒酵母工程菌中外源加入底物構建了牛心果堿及后續的BIAs (血根堿和小檗堿) 的生物合成途徑[86]。Nakagawa等通過分步發酵的方法構建了產牛心果堿的大腸桿菌工程菌，產量達到48.0 mg/L，高于酵母工程菌的產量[87]。Thodey等證明了釀酒酵母可以實現由蒂巴因生產包括嗎啡、可待因、氫嗎啡酮、羥考酮等一系列的BIAs，并通過調節基因拷貝數、提高底物供應、均衡表達COR和CODM等功能酶以及定位表達COR于內質網等方法提高了嗎啡及其他阿片類生物堿的產量，總產量可達131 mg/L[88]。Fossati等在釀酒酵母中構建了由(R)-牛心果堿生成可待因和嗎啡的生物合成途徑，他們將SalSyn、SalR和SalAT基因在釀酒酵母中共表達，同時優化了發酵液pH值，使氫化沙羅泰里啶-7-O-乙酸到蒂巴因的自發重排反應更容易進行，最終通過共表達7個基因及飼喂底物(R)-牛心果堿實現了可待因和嗎啡的生物合成[81]。隨著DRS和DRR的鑒定，解析了(S)-牛心果堿到(R)-牛心果堿的合成途徑。Galanie等在酵母中實現了阿片類化合物的從頭生物合成，在這個過程中利用了來自植物、哺乳動物、細菌及酵母本身的20多個基因，在釀酒酵母工程菌中產生了蒂巴因和氫可酮，產量分別為6.4 μg/L和0.3 μg/L[82]。

3 黃酮類化合物生物合成

黃酮類化合物廣泛存在于高等植物中，具有C6-C3-C6的基本骨架，化學結構多樣。目前已知的黃酮類化合物約9 000種，按照結構可分為黃酮類、異黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類和花色素類等[89]。黃酮類化合物通常以糖苷的形式存在，多為O-糖苷，也有C-糖苷，它們具有多種多樣的生物學功能，如調節植物生長、保護植物免受紫外線損傷、信號轉導等[90]。同時，黃酮類化合物也具有多種藥理活性，如治療高血壓、糖尿病、冠心病、心絞痛等。黃酮類化合物的生物合成近年來報道較多[91-93]，尤其是燈盞花素的生物合成研究取得了較大的進展。

燈盞花Erigeron breviscapus是中國傳統藥材，黃酮類化合物燈盞花素是其有效成分。燈盞花素主要包括燈盞花乙素(Scutellarin)，還有少量的燈盞花甲素(芹菜素-7-O-葡糖醛酸苷，apigenin-7-O-glucuronide) 等[94-95]。燈盞花素具有擴張血管、抑制血小板聚集、降低血粘度、促進血液循環等藥理作用，臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病。燈盞花素臨床需求極大，從植物中提取不能滿足市場需求，需要開發新的方法補充市場供應，因此應用合成生物學技術生產燈盞花素得到了廣泛的研究。

燈盞花素的生物合成途徑已基本被解析清楚。L-苯丙氨酸(L-phenylalanine) 是莽草酸途徑(植物初級代謝途徑) 的產物，它在苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL) 的催化下生成肉桂酸(Cinnamic acid)。隨后依次經過肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase, C4H)、4-香豆酸CoA連接酶(4-coumaroyl-CoA ligase，4CL)、查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)和查爾酮異構酶(Chalcone isomerase，CHI) 的催化生成p-香豆酸(p-coumaric acid)、香豆酰輔酶A (Coumaroyl-CoA)、柚皮苷查爾酮(Naringenin chalcone) 和柚皮苷(Naringenin)。p-香豆酸也可由酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia lyase，TAL)催化酪氨酸(Tyrosine) 直接生成。黃酮合酶Ⅱ (Flavone synthase Ⅱ，FSⅡ) 催化柚皮苷生成芹菜素(Apigenin)，芹菜素經過黃酮6-羥化酶(Flavone-6-hydroxylase，F6H) 和類黃酮7-O-葡糖醛酸轉移酶(Flavonoid-7-O-glucuronosyltransferase，F7GAT) 的催化生成燈盞花乙素(圖 8)[95-96]。

Watts等將紅球菌來源的TAL基因、擬南芥來源的4CL和CHS基因轉入大腸桿菌，在大腸桿菌中合成了柚皮苷，產量達到20.8 mg/L[97]。Koopman等將擬南芥來源的柚皮苷合成所需基因轉入釀酒酵母中，構建產柚皮苷的釀酒酵母工程菌。通過下調基因Aro3和Aro4減輕反饋抑制作用，敲除基因Aro10、Pdc5和Pdc6以減少副產物生成等方法，提高釀酒酵母底盤細胞中芳香族氨基酸的產量，同時增加CHS的拷貝數、引入莢膜紅細菌來源的TAL，使搖瓶水平柚皮苷的產量與對照相比提高了40倍，2 L發酵罐水平柚皮苷產量達到112.9 mg/L[98]。Wu等開發了一種CRISPR-dCas9干擾系統，通過干擾三羧酸循環、糖酵解等過程相關基因(fumC、sucC和adhE) 以及脂肪酸合成相關基因(fabF和fabB) 的表達，增加乙酰輔酶A的供應，工程菌中柚皮苷的產量達到421.6 mg/L[99]。Miyahisa等在大腸桿菌中表達基因PAL、CHS、4CL和香菇來源的CHI，實現了芹菜素在大腸桿菌中的生物合成，產量為13 mg/L[100]。Thuan等將擬南芥來源的糖基轉移酶AGT引入大腸桿菌中，加入外源的芹菜素，通過補料分批發酵獲得芹菜素-7-O-葡糖醛酸苷，產量為39.28 mg/L[101]。Liu等從燈盞花基因組中鑒定了燈盞花素生物合成途徑中的兩個關鍵酶F7GAT和F6H，將它們與芹菜素合成所需酶基因共同轉入釀酒酵母底盤細胞中，獲得了產燈盞花素的釀酒酵母工程菌。為提高工程菌中燈盞花素的產量，他們敲除基因MLS1和CIT2降低乙酰輔酶A的消耗，過表達基因ALD6、ADH2和ACSSEL641P增加乙酰輔酶A的供應，并優化工程菌的發酵條件，在3 L發酵罐中燈盞花乙素和芹菜素-7-O-葡糖醛酸苷的產量分別達到108 mg/L和185 mg/L[95]。

4 總結與展望

合成生物學的發展實現了利用微生物生產有價值的天然產物，也有效地克服了植物次級代謝產物大規模生產的障礙。最近幾十年，利用基因工程改造微生物使其生產植物來源藥用天然產物取得了巨大進步，這些進步主要是通過目標化合物生物合成途徑的解析及其微生物細胞工廠的建立而實現的[102]。

隨著先進的生物信息學工具、DNA測序、蛋白質工程、代謝途徑優化和尖端發酵技術的開發，藥用天然產物的工業化生產技術快速發展[103]。通過對微生物細胞工廠的優化可以顯著提高目標化合物的產量，主要的優化方法如下：(1) 適度提高基因拷貝數可以提高目標化合物產量。基因拷貝數與目標化合物產量并不完全呈正相關，過度增加基因的拷貝數可能會增加細胞生理負擔，從而影響細胞生長而使目標化合物產量降低[29]。(2) 采用宿主偏愛的密碼子，避免使用稀有密碼子，提高酶異源表達水平，從而提高目標化合物產量。Shao等將3-類固醇脫氫酶進行了密碼子優化，提高了其在枯草芽孢桿菌中的酶活性，與未優化時相比提高了7倍，達到12.3 U/mg[104]。(3) 通過靈活應用強或弱啟動子以及不同啟動子的組合來調整代謝通量，可以提高目標化合物的產量。Liu等通過重置關鍵基因的啟動子來優化糖酵解和芳香族氨基酸生物合成中的碳分布，并引入一種磷酸酮醇酶(PHK) 途徑，構建了一株高產芳香族氨基酸p-HCA的釀酒酵母菌株，其產量高達12.5 g/L[105]。(4) 過表達途徑酶、表達轉錄因子、通過敲除或者反義RNA技術下調支路代謝等方法使代謝通量更多地流向目標化合物。(5) 調整化合物生物合成過程中代謝酶復合物的空間亞細胞位置。Farhi等在釀酒酵母中引入線粒體靶向的FPPS和ADS基因，結合截短的HMG1基因，將紫穗槐二烯的產量提高了20倍[106]。Thodey等將嗎啡生物合成基因COR定位到內質網，與對照組相比(2.5 mg/L)，嗎啡產量提高到3.1 mg/L[88]。(6) 微生物培養條件的優化對于提高目標化合物產量進而擴大生產也至關重要，如培養基pH值、溫度控制、前體飼喂、添加誘導劑等[54,?107-108]。

通過合成生物學技術利用微生物大量生產藥用天然產物雖然已經取得了很大的進展，但仍有一些關鍵問題需要進一步探索：(1) 對藥用天然產物生物合成途徑的解析是構建微生物細胞工廠的重要前提。傳統的技術，如RT-PCR、RNAi、RACE、VIGS等通常耗時費力[109]，而測序技術、組學的發展以及蛋白底物對接、蛋白垂釣等新方法新技術的出現，促進了生物合成途徑中新基因的發現，特別是下游途徑關鍵基因的鑒定，如CYP450酶、糖基轉移酶等[102,?110]。(2) 在微生物中引入大量外源基因會導致代謝不平衡以及中間體積累，從而影響細胞生長及目標化合物產量。通過對基因表達進行調整以及動態調節策略可以優化細胞生長和產物合成之間的平衡[111]。(3) 選擇合適的宿主細胞十分關鍵。在選擇宿主之前應考慮很多因素，所選宿主細胞的基因組序列最好已知，宿主細胞最好能夠產生目標化合物的前體等[89]，用于生產藥品或食品添加劑時還要考慮宿主細胞的安全性。(4) 生產成本是利用微生物細胞工廠大規模生產藥用天然產物的主要障礙，可以通過使用更加經濟的原料、提高工程化宿主細胞的魯棒性等來降低成本。(5) 在宿主細胞中表達基因簇或來源于不同物種的多個基因的組合來實現目標化合物的合成，并且可以通過具有明確功能的異源酶的組合擴展目標化合物的天然合成途徑。(6) 新的分子生物學工具以及合成生物學技術的開發與應用可以為微生物細胞工廠的構建及優化提供便利[97]。用于基因組挖掘的計算工具的開發可以加速基因的發現，用于工程菌培養的生物反應器的開發也將有利于擴大培養規模和提高產物回收效率。

相比于傳統的植物提取、化學合成等生產方式，利用合成生物學技術通過微生物細胞工廠生產藥用天然產物具有不受外界環境影響、生長速度快、遺傳操作簡單、易于大規模培養以及環境友好等多種優勢。隨著分子生物學以及生物信息學的發展，對宿主細胞的改造及生物合成基因表達調控將越來越容易，越來越多的藥用天然產物將會通過微生物細胞工廠實現大量生產。