? ? ? ? ? 酵母雙雜交系統是一種在酵母這種真核生物模型中執行的實驗方法，用于探索活細胞內部蛋白質間的相互作用。這種技術能夠敏感地捕捉蛋白質間的細微和短暫相互作用，通過檢測報告基因的表達產物來實現。作為一種高度靈敏的技術，酵母雙雜交系統被廣泛應用于研究哺乳動物和高等植物基因組編碼的蛋白質之間的交互作用，這一點已被眾多研究文獻所證實。

酵母文庫的構建流程

? ? ? ? 為了探索特定蛋白質與其它蛋白質的交互作用，科學家們開發了酵母文庫技術。這種“文庫”實際上是一個包含了所有基因的龐大數據庫。在這個過程中，首先從目標物種提取總RNA，然后從中分離出mRNA。隨后，這些mRNA通過逆轉錄過程轉換成cDNA。接下來，將這些cDNA與激活域（AD）載體連接，構建出一個AD文庫。將此文庫引入到酵母細胞中后，理論上這些酵母細胞就能夠表達目標物種的全部蛋白質，從而便于研究它們之間的相互作用。

圖1 酵母文庫構建流程

酵母文庫的構建方法

? ? ? ?酵母文庫的構建方法主要有兩種：SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）擴增技術和Gateway重組技術，選哪種方法建庫，主要看起始RNA量。

? ? ? ?SMART技術：即RNA模板5'末端轉換機制，可以連續合成5'非翻譯區的序列，包含了更大比例的全長克隆。SMART技術，指的是合成的cDNA和線性化的載體共同轉化酵母，在體內重組酶的作用下cDNA和載體相連形成完整的質粒。通過SMART技術構建的cDNA文庫能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，保存了生物遺傳信息的完整性。

? ? ? ?Gateway技術：利用專有的重組序列使得DNA片段能夠更有效地被轉入質粒當中，可應用于大片段的基因克隆，并且在保持正確閱讀框的前提下讓不同表達載體間的DNA轉移成為可能。建庫過程中不經PCR擴增，所以要求起始RNA量高，需達到300 μg以上。在樣本量充足條件下，Gateway法酵母文庫，避免了PCR擴增對文庫的影響，如低豐度基因丟失和擴增過程中可能產生的個別堿基突變。

? ? ? ?我司目前主要使用Gateway重組技術進行酵母文庫構建。它們的區別如圖三所示：

Invitrogen體系，采用Gateway位點特異性重組技術（Invitrogen專利）構建文庫 。

圖2?Gateway技術的原理圖

??????????圖3 酵母建庫方法比較

建庫材料的選擇：

? ? ? ? 目前我們公司酵母建庫材料可以選擇動物組織、貼壁/懸浮細胞、種子和植物組織等樣品。客戶需提供至少能提取500μg總RNA的新鮮樣本，具體要求如表一所示:

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注：對于樣品，客戶可根據自己的實驗目的選取材料的部位和時期，可以是某一時期的某一部位樣品，也可以是某一時期的整個植株樣品，具體需要依據實驗目的而定；一般不同處理條件下的材料需要分別建庫，如果客戶要求混合建庫也是可以的。

酵母文庫交付標準：

1、原始文庫容量大于1*10^7 CFU；

2、平均插入片段大于1200bp（部分物種達不到）；

3、克隆陽性率大于95%。

酵母文庫的篩選方法

? ? ? ?首先,在進行蛋白質相互作用的酵母雙雜交篩選時，使用的菌株類型會根據研究的體系而有所不同。對于核內蛋白質的相互作用研究，通常采用Y2HGold酵母菌作為共轉方式的篩選平臺；而對于膜相關蛋白質的研究，則更傾向于使用NMY51菌株。在核內體系的研究中，除了共轉篩選方法外，還可以采用配對（mating）方法。配對方法涉及到兩種不同性別的酵母菌株：一種是攜帶AD文庫質粒的Y187菌株，另一種則是含有BD（結合域）質粒的Y2HGold菌株。通過這兩種菌株的交配，可以高效地篩選和鑒定蛋白質之間的相互作用。

以下是兩種體系的篩庫主要流程：

核體系篩庫實驗流程：

膜體系篩庫實驗流程：

? ? ? ? 在酵母雙雜交系統中，篩選陽性克隆的方法會根據研究的體系（核內或膜相關）而有所區別。對于核內體系，通常使用MEL1作為報告基因。當蛋白質間發生相互作用時，含有X-α-Gal的培養基上的陽性菌落會顯現藍色。而在膜相關體系中，篩選陽性克隆主要依賴于報告基因ADE2的表達水平。具體來說，當不存在蛋白質相互作用時，腺嘌呤的合成受到阻礙，導致細胞中某些中間產物積累，使得細胞表現為紅色。這種顏色變化為鑒定蛋白質間相互作用提供了一種可視化的方法。（2）有互作蛋白時，由于作用強度不同克隆顏色不一。克隆呈現粉白（弱相互作用）至白色（強相互作用）。

卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)?具有十余年文庫技術沉淀，具有豐富的樣品處理經驗和建庫經驗。

案例

酵母雙雜交文庫構建及文庫篩選服務文獻案例：

1、 total RNA提取：

2、 mRNA純化

3、 初級文庫片段長度與陽性率驗證

初級文庫：長度范圍300－3000bp，平均長度>1200bp，陽性率100%

4、次級文庫片段長度與陽性率驗證

次級文庫：長度范圍：650-3000bp，平均長度>1200bp，陽性率100%

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