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篇一：虛擬實驗報告

第一章 文獻綜述

1.1 丙酮酸脫氫酶概述

丙酮酸脫氫酶復合體(Pyruvate Dehydrogenase Complex)催化丙酮酸不可逆的氧化脫羧轉化成乙酰輔酶A。該復合體是糖酵解的關鍵限速酶，產物乙酰輔酶A進入三羧酸循環和氧化磷酸化。丙酮酸脫氫酶復合體在細胞能量代謝調控中的作用至關重要(Skorokhodova et al., 2011)。

在原核生物中，丙酮酸脫氫酶復合體存在于細胞質中。在哺乳動物細胞中，丙酮酸脫氫酶復合體主要定位在線粒體上，整個復合體的各個組成酶都是由核基因編碼的，在核糖體上表達，轉運到線粒體中。高等植物細胞有兩種不同的丙酮酸脫氫酶復合體形式，一種是線粒體丙酮酸脫氫酶復合體，另一種是定位在質體基質中的質體丙酮酸脫氫酶復合體。目前認為，線粒體丙酮酸脫氫酶復合體催化反應生成的乙酰輔酶A進入三羧酸循環徹底氧化產生能量，而質體丙酮酸脫氫酶復合體催化反應生成的乙酰輔酶A則進入脂肪酸合成途徑(Bhavnani and Wallace, 1990)。

1.2 丙酮酸脫氫酶結構研究

原核細胞如大腸桿菌的丙酮酸脫氫酶復合體由丙酮酸脫氫酶(E1，EC )、二氫硫辛酸乙酰轉移酶(E2，EC 2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3，EC )組成，這三個組成酶都結合了不同的輔助因子，其中E1結合了輔助因子焦磷酸硫胺素(thiamin diphosphate，TPP)和Mg2+；E2的賴氨酸殘基上共價結合了硫辛酸(lipoic acid)；E3緊密結合了FAD分子。整個復合體由24個E2單體構成核心框架結構，24個E1單體和6個E3單體結合在E2核心框架上(Bosma et al., 1982)。

真核生物的丙酮酸脫氫酶復合體除了含有上述的E1、E2、E3外，還有調節它活性的丙酮酸脫氫酶激酶(Pyruvate Dehydrogenase Kinase)、丙酮酸脫氫酶磷酸酶(Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase)以及E3結合蛋白(E3 Binding Protein)。整個復合體核心框架結構由60個E2單體以及12個E3結合蛋白單體組成，在其周圍結合有20－30個E1異型四聚體(22)、6－12個E3同型二聚體、1－2個丙酮酸脫氫酶激酶同型/異型

22四聚體的形式存在，和亞單位的分子量分二聚體以及2－3個丙酮酸脫氫酶磷酸酶異型二聚體(Kresze and Ronft, 1981)。 人丙酮酸脫氫酶復合體E1是以位點位于和別是41和36 kDa。根據人E1的X-射線晶體結構，輔助因子焦磷酸硫胺素和Mg2+的結合二個亞基之間的界面處的深溝內。

(轉載于:www.zaIdian.cOM 在點 網)人丙酮酸脫氫酶復合體E2含有四個結構域：兩個硫辛酸結構域(lipoyl domain)，每個硫辛酸結構域的一個賴氨酸殘基上共價結合了一個輔助因子硫辛酸；一個亞基結合結構

域(subunit-binding domain)，與E1相結合；一個核心結構域(inner domain or core domain)，60個E2通過這個核心結構域結合在一起。硫辛酸結構域的賴氨酸殘基側鏈氨基和硫辛酸共價結合形成了一個長的“搖動的手臂”連接E1、E2和E3的活性中心，將底物和產物傳送到不同的活性中心。E2的四個結構域之間由富含脯氨酸和丙氨酸的連接區域連接，連接區域的多肽鏈形成柔性的無規卷曲構象。人丙酮酸脫氫酶復合體中的E3結合蛋白是一種和E2類似的亞基，它由一個硫辛酸結構域、一個結合E3的亞基結合結構域以及一個核心結構域組成。目前，E2的整體三維結構還沒有文獻報導，只得到了它的部分結構域的三維結構，如使用X-射線散射和電子顯微鏡技術測定的核心結構域形成的多聚復合體的低分辨三維結構(Schulze et al., 1991)。

和真核生物不同，大腸桿菌E1是同一單體形成的非對稱二聚體，E1單體由886個氨基酸殘基組成。焦磷酸硫胺素和Mg2+結合在二個亞基之間的界面處，E1的 N－末端結構域(1－55氨基酸殘基)三維結構無法在X-射線晶體衍射中得到，將E1的N－末端16－25、26－35、36－45氨基酸殘基分別去除的突變體沒有活性，而去除46－55氨基酸殘基的突變體仍保持活性；同時，對E1的7－15氨基酸殘基進行的點突變研究也證明E1的N-末端結構域對于整個大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復合體的活性以及E1和E2之間的結合非常重要。隨后的核磁共振研究發現N－末端結構域和E2的亞基結合結構域而不是硫辛酸結構域結合。利用三維結構預測軟件對這55個氨基酸序列進行預測，結果顯示它可能含有2個-螺旋，與E2的亞基結合結構域的-螺旋相互結合(Arjunan et