在微生物實驗中，細菌濃度的精準測定和菌種的準確鑒定是兩項基礎且核心的操作。本文將詳細介紹相關技術的原理、操作步驟及注意事項，為新手提供系統性指導。

一、細菌濃度測定方法

1. 光密度法（OD600）：快速定量的首選

原理

OD600 測定基于光散射原理：當 600nm 波長的光穿過菌液時，細菌會對光產生散射，散射強度與菌液中細菌濃度在一定范圍內（通常 0.1-0.8 OD 值）呈線性正相關。需注意，超過此范圍后線性關系會偏離，例如大腸桿菌在 OD600>0.8 時，數據準確性顯著下降。

操作步驟

• 儀器校準：以空白培養基作為對照調零，建議使用中性密度濾光片驗證儀器精度；固定使用同一臺儀器，并記錄比色皿光程（通常為 1cm）。
• 樣品準備：輕柔混勻菌液（避免產生氣泡影響測定），若 OD 值超過 0.8，需用無菌培養基稀釋至 0.1-0.8 范圍后再測定。
• 測量操作：用擦鏡紙清潔比色皿外壁，每個樣品讀取 3 次取平均值，以減少誤差。
• 濃度計算：最終濃度 = 測定 OD 值 × 稀釋倍數。建議提前繪制 OD 值與活菌數（CFU）的標準曲線，便于直接換算活菌濃度。

注意事項

• 若培養基顏色較深，可通過離心收集細菌沉淀，用 PBS 洗滌后重懸再測定，避免背景干擾。
• 不同儀器的測定結果存在差異，需固定儀器并定期校準，記錄光程參數以保證數據可比性。

2. 平板計數法：活菌定量的 “金標準”

核心概念：CFU

CFU（菌落形成單位）指能在固體培養基上形成一個菌落的活細菌個體（可能是單個細菌或團聚的細菌群），僅反映活菌數量，是活菌定量的直接方法。

計算公式

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CFU/mL =（菌落數 × 稀釋倍數）÷ 接種體積（mL）

操作流程

• 樣品稀釋：采用無菌生理鹽水或 PBS 進行 10 倍梯度稀釋（如 10?1 至 10??），每稀釋度更換無菌槍頭，防止交叉污染。
• 培養基制備：選擇適宜的固體培養基（如 LB 瓊脂），滅菌后冷卻至 50℃左右倒平板，90mm 直徑平板的培養基用量約 20mL，厚度均勻可保證菌落生長一致性。
• 接種方法：
  • 涂布法：取 100μL 稀釋液滴加至平板，用無菌涂布棒均勻涂布。
  • 傾注法：取 1mL 稀釋液與融化的瓊脂培養基混合后倒平板。
• 培養條件：根據細菌特性設置溫度（通常 30-37℃），培養 18-48 小時，保持培養環境濕度適宜。
• 計數規則：選擇菌落數在 30-300 之間的平板計數，菌落數過少或過多均會導致結果偏差，可借助菌落計數器提高效率。

二、菌種鑒定技術

1. 傳統鑒定方法

革蘭氏染色：細胞壁特性鑒別

• 原理：革蘭陽性菌細胞壁較厚，含肽聚糖多，與結晶紫結合穩定，經酒精脫色后仍保留紫色；革蘭陰性菌細胞壁薄，肽聚糖少，結晶紫易被洗脫，復染后呈紅色。
• 操作要點：
  • 涂片厚度適中，避免重疊影響觀察。
  • 染色步驟嚴格控制時間：結晶紫染色 1 分鐘→碘液媒染 1 分鐘→酒精脫色 30 秒（關鍵步驟，時間需精準）→番紅復染 30 秒。

氧化酶試驗：呼吸類型輔助判斷

• 原理：檢測細菌是否含細胞色素 c 氧化酶，陽性菌可使四甲基對苯二胺試劑在 30 秒內變藍，陰性菌無顏色變化。
• 注意事項：使用新鮮培養的細菌，避免用含鐵工具接觸試劑，防止假陽性。

2. 分子鑒定方法：精準到種級

16S rRNA 測序：細菌 “分子身份證”

• 原理：16S rRNA 基因在細菌中高度保守且種間存在特異性差異，長度約 1500bp，數據庫完善，通過序列比對可實現精準鑒定。
• 操作關鍵：
  • DNA 提取：選用對數期細菌（OD600≈0.6），革蘭陽性菌需用溶菌酶預處理以破壞細胞壁，提取后用 RNase 去除 RNA 污染。
  • PCR 擴增：常用引物 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；反應程序：94℃預變性 5 分鐘，35 個循環（94℃變性 30 秒→55℃退火 30 秒→72℃延伸 90 秒），最后 72℃延伸 10 分鐘。
  • 序列分析：拼接測序結果后，通過 NCBI BLAST 等工具與數據庫比對，確定菌種分類。

總結

細菌濃度測定中，OD600 法適合快速定量，平板計數法適合活菌精準計數，兩者可結合使用（如通過標準曲線關聯 OD 值與 CFU）。菌種鑒定方面，傳統方法（革蘭氏染色、生化試驗）可快速初步分類，分子方法（16S rRNA 測序）可實現精準鑒定。實際操作中需根據實驗目的選擇合適方法，并嚴格遵循無菌操作與實驗規范，以保證結果可靠性。

通過掌握上述基礎技術，可為后續微生物功能研究、發酵優化等實驗奠定堅實基礎。