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文獻

The regulatory role of cancer stem cell marker gene CXCR4 in
the growth and metastasis of gastric cancer
IF:6.8 中科院分區:1區 醫學WOS分區: Q1
目的：通過 scRNA-seq 結合大量 RNA-seq 揭示癌癥干細胞 （CSCs） 標志基因 CXCR4 在胃癌 （GC） 生長和轉移中的分子機制

introduction

癌癥干細胞 （CSC） 是可誘導腫瘤起始并導致復發的腫瘤細胞亞群，CSC 的表征對于癌癥診斷、治療和預后很重要.CXCR4 被確定為一種趨化因子受體，與免疫疾病和癌癥等多種病理狀況有關。此外，CXCR4 是 CSC 標記基因之一.打算使用 scRNA-seq 結合大量 RNA-seq 來探索 CXCR4 在 GC 中的可能參與，以確定治療 GC 的潛在基因。

result

1scRNA-seq 數據分析在 GC 組織中鑒定出大量高度可變的基因

首先，通過 GEO 數據庫下載來自 GSE163558 的 7 個 GC 相關 scRNA-seq 數據，包括 3 個原位腫瘤樣本、2 個淋巴結轉移腫瘤樣本和 2 個肝轉移腫瘤樣本，并使用 R 包“Seurat”進行 scRNA-seq 數據分析。然后，經過質量控制和scRNA-seq數據的標準化，過濾掉低質量的細胞（過濾閾值：nFeature_RNA > 500 & nCount_RNA > 1000 & nCount_RNA < 20,000 & percent.mt <10）（補充圖。nCount 和 percent.mt 之間的相關系數 （r） 為 0.18，nCount 和 nFeature 之間的相關系數 （r） 為 0.91（補充圖 1）。1B），這表明過濾后的細胞質量良好。

然后，從過濾后的細胞中鑒定出 GC 中的高可變基因，共納入 24,924 個基因進行基因表達方差分析，以鑒定高可變基因。最后選擇關于方差的前 2000 個高度可變的基因進行下游分析（補充圖 D）。1C）。
點評：湊結果，沒啥好說的。

GC 組織樣品的 scRNA-seq 數據的 PCA

通過 UMAP 分析進一步研究 GC 組織中的細胞異質性。UMAP 將降維（例如 PCA）與最近鄰網絡上的隨機游走相結合，以將高維數據映射到二維空間，同時保持單元之間的局部距離。與 PCA 相比，UMAP 是一種隨機算法，這意味著在同一數據集上運行的多種方法將產生不同的圖26。通過 UMAP 方法分析后，將所有細胞聚集成 19 個細胞簇（圖 D）。通過進一步校正數據，我們發現不同樣本來源之間沒有顯著差異，但細胞簇的比例不同（圖 D）。此外，我們根據數據源顯示了細胞類型的相似性和差異性（圖 D）。1C， D）。
我們根據 CellMarker 數據庫中的標記基因注釋了 19 個細胞簇：T 細胞（CD8A、CD3D 和 CD3E）、B 細胞（CD19、CD79A 和 MS4A1）、髓樣細胞（CD14 和 CD163）、上皮細胞（EPCAM、KRT18 和 KRT19）、NK 細胞（KLRD1 和 IL2RB）和基質細胞（THY1、ENG 和 VWF）。基于這些標記，我們最終注釋了 6 種類型的細胞，其中免疫細胞占 93.8%（圖1E 和 2 & 補充表 1）.隨后，我們分析了 GC 樣品中每種細胞的比例，如圖 1 所示。1F. 不同 GC 樣本中每種細胞類型的比例差異很大，上皮細胞、髓系細胞和基質細胞主要起源于原發病灶，而 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞主要起源于轉移病灶。此外，我們進一步繪制了 GC 腫瘤組織中前 10 個細胞特異性標記基因的表達譜（圖 D）。1G）。
點評：cellmarker注釋快，因為是基本細胞，估計沒啥偏差。C圖表示無樣本批次效應，D、F圖展示不同狀態樣本的細胞比例，E注釋，G簇的特異marker

GC 樣品來源的上皮細胞可進一步分為惡性和非惡性上皮細胞

GC 主要起源于胃粘膜的腺上皮27，因此我們將上皮細胞進一步分為惡性細胞和非惡性細胞。使用髓樣細胞作為對照，我們使用 “inferCNV” 包來檢測大規模細胞拷貝數變異。結果顯示，大部分 CNV 發生在上皮細胞中（圖 D）。隨后，將“觀察”中的正常細胞和上皮細胞分為六類，結果顯示第 3 類和第 4 類包含所有 CNV 評分最低的正常細胞，在排除第 3 類和第 4 類后，隨后獲得了 1314 個惡性上皮細胞（圖 D）。3B-D）。
所得惡性上皮細胞進一步聚集成 4 類，分別命名為 C1、C2、C3 和 C4（圖 D）。3E）的分析顯示，每個 GC 樣品都分布在 C1-C4 細胞簇中（圖 D）。此外，我們在簇 C1-C4 中繪制了前 10 個細胞特異性標記表達譜基因。我們顯示了這些特異性標記基因的表達，即 C1 中的 S100A6、KRT8 和 TPM1，C2 中的 BASP1、TCL1A 和 RGS13，C3 中的 CCR7、KLF2 和 GRAP，以及 C4 中的 RGCC、CXCR4 和 RGS1 的表達（圖 D）。4A， B）。

點評：infercv不應該能直接獲得惡性上皮細胞么，k-means的步驟是？圖有點模糊。獲得惡性上皮細胞后重聚類，并展示特異marker。

惡性上皮細胞中的 C4 細胞簇可能是 CSCs

已經證明 CSCs 可能是 GC 生長和轉移的關鍵驅動因素28。因此，我們首先從惡性上皮細胞中提取 CSCs。然后，我們使用“Monocle2”軟件包對 C1-C4 惡性上皮細胞進行細胞軌跡分析。圖 5A、B 顯示了惡性上皮細胞的動態特征和異質性，其中 C4 細胞幾乎完全位于偽時間軌跡軸的起點。隨后，我們根據 CSCs 標志物 （TFRC、CXCR4 和 JAG1 等） 的表達對 C1-C4 細胞的干性進行評分。6,29,30.結果表明，C4 細胞的干性分數與 C1-C3 細胞的干性分數顯著不同（圖 D）。5C， D）。
此外，我們分別分析了胃 CSCs 標志物 CD44 在 C1-C4 細胞簇中的表達，并顯示 C4 細胞簇比 C1-C3 細胞簇具有更高的 CD44 表達（圖 D）。5E， F）。此外，細胞遷移和侵襲與 EMT 密切相關;因此，我們根據 ssGSEA 算法進一步計算了 CD44 表達與 EMT 標記基因之間的相關性，結果顯示顯著的正相關（圖 D）。5G）。

點評：AB圖展示C4可能為分化起點，CDEFG看C4與干性的特征是否相關。

CSCs 標志基因 CXCR4 可作為 GC 患者預后的分子標志物

接下來，進一步篩選與 GC 患者預后相關的 CSCs 標志基因。對 CSCs 的 200 個標記基因進行 GO 和 KEGG 功能富集分析。結果發現，它們主要參與核分裂、細胞器裂變、有絲分裂核分裂和染色體分離等生物過程，以及 TNF 信號通路和 NOD 樣受體信號通路（圖 D）
如圖 1 所示。6C，從 TCGA-STAD 結合 GTEx 數據庫篩選 GC 中的 DEGs，然后將這些 DEGs 與 C4 細胞簇的 200 個標記基因相交，獲得 84 個 DEGs（圖 D）。對這 84 個基因進行進一步的生存預后分析，確定了 10 個與生存預后顯著相關的基因，即 RGS2 、 CXCR4 、 KIF11 、 CLSPN 、 KIF20B 、 ZNF331 、 TFRC 、 UBE2T 、 CKS2 和 EZH2。在這 10 個基因中，只有 CXCR4 顯示出預后和表達結果之間的一致性，其中 CXCR4 在 GC 中顯著過表達（圖 D）。6E） 和高 CXCR4 表達表明預后不良（圖 D）。因此，我們選擇了 CXCR4 進行進一步研究。此外，進一步計算了 CXCR4 表達與 EMT 標記基因之間的相關性，結果顯示 CXCR4 表達與 EMT 標記基因表達之間存在顯著的正相關（圖 D）。6G）。

點評：C4簇做通路富集，結合bulk數據分析得到正常癌癥間差異且為癌癥干性細胞的基因、且預后有差異的、且cox與km生存方向一致的CXCR4基因。再看該基因與EMT的關聯性。

抑制 CXCR4 表達抑制 CSCs 惡性表型，延緩體內腫瘤發生和肝轉移

首先，通過流式細胞術對 CD44 + 和 CD44-MKN45 細胞進行分選（圖 D）。7A） 并在無血清條件下培養。隨后，對 CD44 + 和 CD44-MKN45 細胞進行 RT-qPCR，顯示 CD44 + MKN45 細胞中 CXCR4 的表達顯著高于 CD44-MKN45 細胞（圖 4 中的 4 個基因）。7B）。
然后，在 CD44 + MKN45 細胞中敲低 CXCR4 的表達，結果顯示 sh-CXCR4-1 和 sh-CXCR4-2 均可顯著降低 CD44 + MKN45 細胞中 CXCR4 的表達，其中 sh-CXCR4-2 （sh-CXCR4） 具有更高的敲低效率，用于后續實驗（圖 D）。7C， D）。集落形成和 Transwell 測定顯示，與 sh-NC 組相比，sh-CXCR4 組 CD44 + MKN45 細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低（圖 D）。7E， F）。

接下來，將轉染 sh-NC 或 sh-CXCR4 的 CD44 + MKN45 細胞皮下注射或注射到裸鼠尾靜脈中，觀察腫瘤生長和肝轉移。在所有裸鼠中觀察到肉眼可見的腫瘤，并且在研究期間都存活了下來。腫瘤生長和體重測量結果顯示，與 sh-NC 組相比，sh-CXCR4 組裸鼠的腫瘤生長速率顯著降低，腫瘤重量和體積明顯較小，裸鼠體重顯著增加（圖 D）。8A-C）。進一步采用 H&E 染色觀察肝轉移情況，統計轉移性肝結節數。結果顯示，與 sh-NC 組相比，裸鼠 sh-CXCR4 組轉移性肝結節數量顯著增加（圖 .8D-F）。
點評：實驗驗證。
總體：工作量不是很大，但是結果講細一點，感覺內容也挺多的。可學習內容，干細胞分群怎么找的。找完之后怎么跟bulk結合起來。但是感覺跟bulk的結合理論以預后的話，制作了一個結果。