Title

題目

Imaging the structural connectome with hybrid MRI-microscopy tractography

利用混合磁共振成像 - 顯微鏡纖維束成像技術描繪結構連接組

01

文獻速遞介紹

通過多種模態繪制大腦結構能夠增進我們對大腦功能、發育、衰老以及疾病的理解（漢森等人，2022；史密斯等人，2020；斯波恩斯，2013）。人們付出了很多努力，運用從磁共振成像（MRI）到顯微鏡成像等各種方法來創建全面的大腦連接圖譜（埃森等人，2013；吳等人，2014；舍費爾等人，2020；懷特等人，2016）。然而，繪制大型大腦的全腦網絡極具挑戰性。不同的模態能夠通過探測不同的長度尺度以及對不同的組織特征產生敏感性，提供關于潛在組織微觀結構的互補信息。值得注意的是，當在同一組織中結合多種模態時，這能為多尺度神經科學帶來新的機遇。 多年來，化學示蹤劑一直是繪制動物大腦中神經連接通路的重要工具（賈巴迪等人，2015；萊因等人，2007；馬費等人，2022；馬爾科夫等人，2012）。示蹤劑有助于直接可視化注射部位的軸突投射，為腦區間的連接提供高度特異性和敏感性的估計（馬爾科夫等人，2012，2010）。然而，示蹤劑在每只動物中僅限于單次或幾次注射，要實現全腦覆蓋就需要犧牲許多動物，而且綜合不同個體的信息會忽略個體間重要的變異性（萊因等人，2007；馬爾科夫等人，2012，2010）。此外，示蹤劑禁止在人類中使用。 替代的顯微鏡技術是在高空間分辨率下表征纖維結構的關鍵參考測量方法（莫林克等人，2017）。對于在纖維束重建中有用的顯微鏡技術而言，顯微鏡必須提供三維的纖維方向信息。多種顯微鏡方法能夠提供三維信息（例如三維偏振光成像[3D-PLI]（阿克瑟等人，2011；舒伯特等人，2017；雷克福特等人，2015）、顯微計算機斷層掃描（戴爾等人，2017；馬西斯等人，2018）、小角X射線散射（喬治亞迪斯等人，2020）或連續電子顯微鏡（登克和霍斯特曼，2004）），并且在立方毫米水平上的突觸結構已在人類皮質中被繪制出來（沙普森 - 科等人，2024）。然而，這些技術復雜的硬件設備和較長的采集時間限制了它們的廣泛應用。因此，顯微鏡下的方向信息通常僅從較小的組織樣本中以三維形式獲取，或者從腦薄切片中以二維形式獲取，這就無法在靈長類動物大腦中進行三維纖維束重建或全腦連接估計。 相比之下，擴散磁共振成像（dMRI）能夠對大腦結構連接進行無創性繪制（埃德加和格里菲斯，2009）。通過測量水分子在組織中的擴散運動，我們能夠推斷潛在的纖維方向，并通過纖維束成像方法重建白質（WM）纖維束（博利厄，2002）。這有助于對全腦白質結構進行估計，但依賴于通過計算模型從毫米尺度的磁共振信號中估計纖維方向。模型的低分辨率和不準確會在推斷的纖維方向中引入偏差或噪聲，從而在下游的纖維束成像輸出中導致假陽性和假陰性（邁爾 - 海因等人，2017；納特等人，2020；席林等人，2017；托馬斯等人，2014）。盡管如此，由于該方法在無創性腦連接成像方面具有巨大潛力，人們通過驗證研究和方法學進展在理解和克服這些纖維束成像的局限性方面付出了大量努力（安布羅森等人，2020；艾多安和施，2018；卡米尼蒂等人，2021；科特等人，2013；德萊特等人，2019；德爾阿夸，2024；多納休等人，2016；迪爾比等人，2007；吉拉爾等人，2020；馬費等人，2022；席林等人，2019a，2019c；延迪基等人，2022；張等人，2022）。 在此，我們提出一種數據融合方法（霍華德等人，2019），聯合分析來自MRI和顯微鏡的數據，以進行全腦的顯微鏡信息輔助的纖維束成像。我們的框架利用這些模態提供的互補信息來創建三維且高分辨率的混合MRI - 顯微鏡纖維方向（圖1），在促進三維纖維束成像的同時保留顯微鏡成像的獨特優勢。我們使用二維顯微鏡來提供顯微鏡平面內纖維方向的詳細估計，并使用MRI來提供跨平面的方向信息。對于后者，我們使用能夠估計MRI體素內纖維方向分布的模型（貝倫斯等人，2003），而不是每個體素的單一方向（例如來自擴散張量成像的方向）（巴塞爾等人，1994）。通過從這種分布中提取與從顯微鏡得到的平面內方向最匹配的纖維跨平面角度，我們能夠在超過MRI數據的空間分辨率下估計三維纖維方向。擴散磁共振成像的球棍（BAS）方法在每個體素中產生許多方向樣本。然而，這些纖維方向在亞體素空間的精確定位是未知的。在我們的混合方法中，顯微鏡本質上是將三維樣本的跨平面方向指定到它們在體素內的假定位置，以“超分辨”MRI信息。我們的混合MRI - 顯微鏡方法提供：1）三維纖維方向；2）全腦覆蓋；3）高分辨率信息以及對復雜纖維結構的估計，就像顯微鏡所描述的那樣。然后，混合方向被組合成任意分辨率的纖維方向分布（FODs），并輸入到現有的纖維束成像流程中用于纖維束重建。當基于對髓鞘敏感的顯微鏡時，混合方向可能比MRI提供更“髓鞘特異性”的纖維方向分布，因為MRI的纖維方向分布可以代表一系列微觀結構特征，包括軸突、樹突和神經膠質突起（亞歷山大等人，2019；杰斯珀森等人，2007；斯塔尼斯等人，1997）。這些髓鞘特異性的纖維方向分布可能在某些應用中具有優勢，例如定義“髓鞘連接組”或追蹤有髓纖維進入皮質。 我們使用“大麥克”數據集（霍華德等人，2023）來展示我們的方法，這是一個開放獲取的多模態資源，包含來自單個獼猴大腦的死后擴散磁共振成像和顯微鏡數據，具有全腦覆蓋。顯微鏡成像包括偏振光成像（PLI）（阿克瑟，2011；拉森等人，2007；舒伯特等人，2017）以及髓鞘染色（加利亞斯，1971）和尼氏染色組織學（卡達爾等人，2009；皮拉蒂等人，2008）。已經在顯微鏡和MRI之間進行了精確的配準，這對于在體素層面進行有意義的數據融合至關重要（胡薩爾等人，2023a）。將我們的混合方法應用于MRI和偏振光成像數據，我們首先展示如何在不同分辨率下進行混合纖維束成像，并重建跨越整個獼猴大腦的顯微鏡信息輔助的纖維束。在對我們的方法有信心之后，我們接著展示混合纖維束成像如何在神經解剖學和方法學研究中發揮作用。具體而言，我們利用混合輸出研究基于MRI的纖維束成像中的兩個已知挑戰：腦回偏差（席林等人，2017）和瓶頸問題（席林等人，2022），這兩個問題主要是由MRI數據有限的空間分辨率引起的。通過將我們的混合輸出與同一大腦的MRI結果進行比較，我們研究這些挑戰與MRI的分辨率和對比度生成機制之間的關系。然后，我們將混合纖維束成像輸出與從其他動物獲得的示蹤劑數據進行比較（馬爾科夫等人，2012，2010），以證明我們的混合方法在纖維追蹤方面比僅使用MRI的纖維束成像具有更高的特異性。最后，我們使用三種不同的顯微鏡對比度（偏振光成像、髓鞘染色和尼氏染色組織學）進行混合纖維束成像，以展示其在不同類型顯微鏡上的應用。總的來說，我們的方法在不依賴侵入性示蹤劑的情況下保留了顯微鏡成像的優勢，這意味著我們能夠使用一種可在包括人類在內的不同物種間轉換的方法，從單個大腦中估計密集的、由顯微鏡信息輔助的結構連接。

Aastract

摘要

Mapping how neurons are structurally wired into whole-brain networks can be challenging, particularly in largerbrains where 3D microscopy is not available. Multi-modal datasets combining MRI and microscopy provide asolution, where high resolution but 2D microscopy can be complemented by whole-brain but lowresolution MRI.However, there lacks unified approaches to integrate and jointly analyse these multi-modal data in an insightfulway. To address this gap, we introduce a data-fusion method for hybrid MRI-microscopy fibre orientation andconnectome reconstruction. Specifically, we complement precise “in-plane” orientations from microscopy with“through-plane” information from MRI to construct 3D hybrid fibre orientations at resolutions far exceeding thatof MRI whilst preserving microscopy’s myelin specificity, resulting in superior fibre tracking. Our method isopenly available, can be deployed on standard 2D microscopy, including different microscopy contrasts, and isspecies agnostic, facilitating neuroanatomical investigation in both animal models and human brains.

繪制神經元在全腦網絡中的結構連接方式頗具挑戰性，尤其是在無法進行三維顯微鏡成像的大型腦部中。結合磁共振成像（MRI）和顯微鏡成像的多模態數據集提供了一種解決方案，高分辨率但二維的顯微鏡成像可由全腦但低分辨率的MRI成像來補充。然而，目前缺乏統一的方法來以富有洞見的方式整合和聯合分析這些多模態數據。為了填補這一空白，我們引入了一種用于混合MRI - 顯微鏡纖維方向和連接組重建的數據融合方法。具體而言，我們用來自MRI的“跨平面”信息補充顯微鏡提供的精確“平面內”方向信息，以構建三維混合纖維方向，其分辨率遠超MRI，同時保留顯微鏡成像對髓鞘的特異性，從而實現更優的纖維追蹤。我們的方法是公開可用的，可應用于標準二維顯微鏡成像，包括不同的顯微鏡對比度，且不受物種限制，有助于在動物模型和人類大腦中開展神經解剖學研究。

Method

方法

2.1. MRI and microscopy data acquisition

The BigMac dataset was previously acquired and pre-processed asdescribed in Howard et al. (2023). Relevant to this work, an adult rhesusmacaque brain was scanned postmortem on a 7T small animal scanner.Structural images were acquired with multi gradient echo sequence at aspatial resolution of 0.3 mm isotropic, FOV =76.8 × 76.8 × 76.8 mm,TE/TR = 7.8/97.7 ms, and flip angle = 30?.Postmortem dMRI was acquired with spin echo 2D multi-slicesequence and single-line readout: 0.6 mm isotropic resolution datawith 128 gradient directions at b = 4 ms/μm2 and 8 with negligibleweighting, and 1 mm isotropic resolution data with 250gradient directions at b = 4 ms/μm2 and 10 with negligible diffusionweighting.After the scanning, the brain was sectioned into two blocks (anterior/posterior halves). Each block was sectioned into thin (50/100 μm)slices and allocated to one of six interleaved contrasts: polarised lightimaging (PLI) (Axer, 2011; Axer et al., 2001, 2011; Larsen et al., 2007),Cresyl violet staining for Nissl bodies (K′ adar′ et al., 2009; Pilati et al.,2008), Gallyas silver staining for myelin (Gallyas, 1971) and threeunassigned sections that were stored for longevity. The slice thicknesswas 50 μm for 5 out of the 6 sections (including PLI, Nissl andmyelin-stained sections) with one section 100 μ**m thick. Each section ofthe same contrast was repeated every 350 μm.PLI estimated the primary fibre orientation based on the birefringence of myelinated axons with a resolution of 4 μm per pixel (Axer,2011; Axer et al., 2001, 2011; Larsen et al., 2007). Images were acquiredas the analyser (rotatable polariser) was rotated through 180?, with a20? angular resolution. Images were background corrected after which asinusoid was fitted to the measured intensity at each pixel (I) as afunction of analyser rotation (ρ). The phase of the sinusoid described thein-plane fibre orientation. Retardance and transmittance maps were alsocalculated and here used only for visualisation and to drive theco-registration respectively.Histology slides with Gallyas silver staining (myelin) and Cresyl violet staining (Nissl bodies) were digitised at a spatial resolution of 0.28μm/pixel. 2D structure tensor analysis (Bigun et al., 2004; Budde andAnnese, 2013; Budde and Frank, 2012) of the stained sections (using aGaussian kernel with sigma=10 pixels) was used to estimate the fibreorientations for each microscopy pixel.

2.1. 磁共振成像（MRI）和顯微鏡數據采集 大麥克（BigMac）數據集先前已按照霍華德等人（Howard et al., 2023）所描述的方式進行了采集和預處理。與這項工作相關的是，一個成年恒河猴大腦在死后于7T小動物掃描儀上進行掃描。結構圖像采用多梯度回波序列采集，空間分辨率為各向同性0.3毫米，視野（FOV） = 76.8×76.8×76.8毫米，回波時間（TE）/重復時間（TR） = 7.8/97.7毫秒，翻轉角 = 30度。 死后擴散磁共振成像（dMRI）使用自旋回波二維多層序列和單線讀出進行采集：各向同性分辨率為0.6毫米的數據，在b = 4毫秒/平方微米下有128個梯度方向，另有8個方向的權重可忽略不計；各向同性分辨率為1毫米的數據，在b = 4毫秒/平方微米下有250個梯度方向，還有10個方向的擴散權重可忽略不計。 掃描后，大腦被切成兩塊（前半部分/后半部分）。每一塊被切成薄切片（50/100微米），并被分配到六種交錯對比度中的一種：偏振光成像（PLI）（阿克瑟，2011；阿克瑟等人，2001，2011；拉森等人，2007）、用于尼氏小體的甲酚紫染色（卡達爾等人，2009；皮拉蒂等人，2008）、用于髓鞘的加利亞斯銀染色（加利亞斯，1971）以及三個為長期保存而儲存的未分配切片。其中五個切片（包括偏振光成像、尼氏染色和髓鞘染色切片）的切片厚度為50微米，另一個切片厚度為100微米。具有相同對比度的每個切片每隔350微米重復一次。 偏振光成像（PLI）基于有髓軸突的雙折射估計主要纖維方向，分辨率為每像素4微米（阿克瑟，2011；阿克瑟等人，2001，2011；拉森等人，2007）。在分析器（可旋轉偏振器）旋轉180度的過程中采集圖像，角度分辨率為20度。對圖像進行背景校正后，將正弦曲線擬合到每個像素處測量的強度（I），作為分析器旋轉（ρ）的函數。正弦曲線的相位描述了平面內的纖維方向。同時計算了相位延遲圖和透射圖，在此分別僅用于可視化和驅動配準。 經加利亞斯銀染色（髓鞘）和甲酚紫染色（尼氏小體）的組織學切片以0.28微米/像素的空間分辨率進行數字化。對染色切片進行二維結構張量分析（比貢等人，2004；布德和安內斯，2013；布德和弗蘭克，2012）（使用標準差為10像素的高斯核）來估計每個顯微鏡像素的纖維方向。

Results

結果

Note, we use the term MRI-microscopy to refer to the generalmethod, as multiple microscopy contrasts can be used to create hybridorientations. MRI-PLI is used to denote the hybrid orientations reconstructed using PLI which estimates the in-plane fibre orientation basedon tissue birefringence (Axer, 2011; Axer et al., 2001, 2011; Larsenet al., 2007).

需注意，我們使用“磁共振成像-顯微鏡成像”這一術語來指代通用方法，因為可以利用多種顯微鏡成像對比度來創建混合取向。“磁共振成像-偏振光成像（MRI-PLI）”用于表示通過偏振光成像（PLI）重建的混合取向，偏振光成像（PLI）是基于組織雙折射來估計平面內纖維取向的（阿克瑟，2011年；阿克瑟等人，2001年、2011年；拉森等人，2007年） 。

Figure

圖

Fig. 1. The hybrid MRI-microscopy approach.a) Our data fusion method leverages the complementary strengths of diffusion MRI and microscopy. Each 2D microscopy orientation was warped to dMRI space andcompared to the BAS samples in the same voxel, where the BAS samples were first projected onto the microscopy plane to facilitate fair comparison with the 2Dmicroscopy. The microscopy through-plane information was then approximated using that from the BAS sample selected by the error-based matching process. b) Theerror based matching process. The diffusion BAS and microscopy in-plane orientation were used as inputs. The 3D BAS orientation was decomposed into the throughplane angle and in-plane angle by projecting onto the microscopy plane. The in-plane angle was compared to the target microscopy in-plane orientation byquantifying the angle difference. We selected the BAS sample with the smallest in-plane angle difference weighted by the BAS signal fraction (related to the volumefraction where more dominant fibre bundles have higher signal fractions) and determined the matched through-plane angle.

圖1. 混合磁共振成像（MRI）-顯微鏡方法 a) 我們的數據融合方法利用了擴散磁共振成像（dMRI）和顯微鏡的互補優勢。每個二維顯微鏡方向被映射到擴散磁共振成像（dMRI）空間，并與同一體素中的球棍模型（BAS）樣本進行比較，其中球棍模型（BAS）樣本首先被投影到顯微鏡平面，以便與二維顯微鏡進行公平比較。然后，使用基于誤差匹配過程所選擇的球棍模型（BAS）樣本的信息來近似顯微鏡的跨平面信息。 b) 基于誤差的匹配過程。擴散球棍模型（BAS）方向和顯微鏡平面內方向被用作輸入。三維球棍模型（BAS）方向通過投影到顯微鏡平面分解為跨平面角度和平面內角度。通過量化角度差異，將平面內角度與目標顯微鏡平面內方向進行比較。我們選擇平面內角度差異最小的球棍模型（BAS）樣本，該樣本由球棍模型（BAS）信號分數（與體積分數相關，更占主導地位的纖維束具有更高的信號分數）加權，并確定匹配的跨平面角度。

Fig. 2. The angle component used in the hybrid orientation reconstruction.a) The PLI in-plane orientation. b) The in-plane orientation from the diffusion BAS decomposition (represented by the angle of the 3D dMRI vector projected onto themicroscopy plane). Here we show the in-plane angle of the BAS sample that is most similar to the PLI. c) The through-plane orientation from the diffusion BASdecomposition (inclination angle); d) The in-plane angle difference between the target PLI orientation and the most similar BAS fibre orientation showing a smallangle difference. e) The PLI hue-saturation-value with the colour-coded orientations.

圖2. 混合方向重建中使用的角度分量 a) 偏振光成像（PLI）的平面內方向。 b) 來自擴散球棍模型（BAS）分解的平面內方向（由三維擴散磁共振成像（dMRI）向量投影到顯微鏡平面的角度表示）。在此，我們展示與偏振光成像（PLI）最相似的球棍模型（BAS）樣本的平面內角度。 c) 來自擴散球棍模型（BAS）分解的跨平面方向（傾斜角度）。 d) 目標偏振光成像（PLI）方向與最相似的球棍模型（BAS）纖維方向之間的平面內角度差，顯示出較小的角度差異。 e) 帶有按顏色編碼方向的偏振光成像（PLI）的色調-飽和度-明度值。

Fig. 3. An overview of the analysis pipeline.A) BigMac includes co-registered microscopy (PLI, myelin- and Nissl-staining) and postmortem MRI (dMRI/structural). B) Fibre orientations are extracted from eachmicroscopy contrast (in-plane angle from PLI, structure tensor analysis from histology) and dMRI (Ball and Stick model). C) Hybrid orientations are generated withthe in-plane orientation from microscopy and through-plane orientation from dMRI. D) The tractography results are optimised with XTRACT probability maps andoutlier removal.

圖3. 分析流程概述 A) “大麥克（BigMac）”數據集包含已配準的顯微鏡成像數據（偏振光成像（PLI）、髓鞘染色和尼氏染色）以及死后磁共振成像數據（擴散磁共振成像（dMRI）/結構成像）。 B) 從每種顯微鏡成像對比度（偏振光成像的平面內角度、組織學的結構張量分析）和擴散磁共振成像（采用球棍模型）中提取纖維方向。 C) 利用顯微鏡成像的平面內方向和擴散磁共振成像的跨平面方向生成混合方向。 D) 利用XTRACT概率圖和去除異常值來優化纖維束成像結果。

Fig. 4. Comparison between dMRI FOD and hybrid MRI-PLI FOD.The FOD generated from the Ball and Stick model (Top), constrained spherical deconvolution (Middle) and hybrid MRI-PLI (Bottom). The orientations in sagittal,coronal and transverse views are presented for U-fibres (left and right), a region covering the corpus callosum and centrum semiovale (middle left) and cortex (middleright). The PLI hue-saturation-value with the colour-coded orientations is provided at the bottom, and the contrast has been edited to highlight the grey matter. Notethe colour schemes for the FODs and PLI are not equivalent

圖4. 擴散磁共振成像（dMRI）的纖維方向分布（FOD）與磁共振成像（MRI）和偏振光成像（PLI）混合的纖維方向分布（FOD）的比較 由球棍模型生成的纖維方向分布（頂部）、約束球形反卷積生成的纖維方向分布（中間）以及磁共振成像（MRI）和偏振光成像（PLI）混合生成的纖維方向分布（底部）。呈現了矢狀面、冠狀面和橫斷面視圖中U形纖維（左右兩側）、涵蓋胼胝體和半卵圓中心的區域（中左側）以及皮質（中右側）的方向。底部給出了帶有按顏色編碼方向的偏振光成像的色調-飽和度-明度值，并且對對比度進行了編輯以突出灰質。請注意，纖維方向分布（FOD）和偏振光成像（PLI）的配色方案并不相同。

Fig. 5. Tracts generated using the hybridtractography.a) The hybrid method can successfully reconstruct tracts throughout the brain including the corticospinal tract, an example tract within the coronal plane wheremicroscopy is the most informative (Top), the optic radiation, a tract extending primarily along the anterior-posterior axis where dMRI provides most information(Middle), and the uncinate fibre (Bottom), a tract connecting the anterior temporal lobe and the orbitofrontal cortex. The anatomical features of interest are labelledwith white boxes. The background anatomical image is the fractional anisotropy behind the tracts for visualisation. b) A whole-brain tractogram is shown. Tenexample tracts generated from the hybrid tractography at 0.6 mm isotropic are illustrated including the superior thalamic radiation (STR), frontal aslant (FA),corticospinal tract (CST) in the coronal view, forceps major (FMA), forceps minor (FMI) in the axial view, uncinate fasciculus (UF), fornix (FX), inferior longitudinalfasciculus (ILF), cingulum subsection: dorsal (CBD), optic radiation (OR) in the sagittal view.

圖5. 利用混合纖維束成像生成的纖維束 a) 混合方法能夠成功重建全腦的纖維束，包括皮質脊髓束。冠狀面內的一個纖維束示例中，顯微鏡成像提供了豐富的信息（上方）；視輻射，這一纖維束主要沿前后軸延伸，其中擴散磁共振成像（dMRI）提供了大部分信息（中間）；還有鉤束（下方），它是連接前顳葉和眶額皮質的纖維束。感興趣的解剖特征用白色方框標記。背景解剖圖像是纖維束背后的各向異性分數，用于可視化。 b) 展示了全腦纖維束圖。展示了由各向同性分辨率為0.6毫米的混合纖維束成像生成的十個示例纖維束，包括丘腦上輻射（STR）、額斜束（FA），冠狀面中的皮質脊髓束（CST）、大鉗（FMA）、軸面中的小鉗（FMI）、鉤束（UF）、穹窿（FX）、下縱束（ILF）、扣帶的一個亞段：背側扣帶（CBD）、矢狀面中的視輻射（OR）。

Fig. 6. High resolution hybrid tractography eliminates the gyral bias.a) Gyral bias. Diffusion tractography trajectories (streamlines) predominantly terminate at the gyral crowns but fail to turn into the gyral wall. The ground truth gyralfanning is demonstrated using PLI and a schematic representation of fibre connections. b) Gyral fanning at different resolutions. FODs (Top) and tractographystreamlines of two gyri which primarily lie within (Middle) and through (Bottom) the microscopy plane. Outputs are shown for dMRI and hybrid MRI-PLI reconstructed at different isotropic resolutions. The gyral bias problem is present in the 1 mm, whilst the high spatial resolution of 0.4 mm successfully delineates theexpected fibre fanning

圖6. 高分辨率混合纖維束成像消除腦回偏差 a) 腦回偏差。擴散纖維束成像的軌跡（流線）主要終止于腦回頂部，但無法延伸至腦回壁。利用偏振光成像（PLI）以及纖維連接的示意來展示真實的腦回扇形結構。 b) 不同分辨率下的腦回扇形結構。纖維方向分布（FODs，上方）以及位于顯微鏡平面內（中間）和穿過顯微鏡平面（下方）的兩個腦回的纖維束成像流線。展示了擴散磁共振成像（dMRI）以及在不同各向同性分辨率下重建的混合磁共振成像 - 偏振光成像（MRI-PLI）的結果。1毫米分辨率下存在腦回偏差問題，而0.4毫米的高空間分辨率成功描繪出預期的纖維扇形結構。

Fig. 7. Hybrid tractography preserves topography in the internal capsule.a) Bottleneck problem. An example in the internal capsule (IC) is shown (Adapted from Schilling et al., 2022). Two fibre bundles, originating and terminating atdifferent locations converge with similar orientations within the bottleneck region (truth axonal connection). Fixels (fibre orientations per voxel) are classified basedon the number of fibre bundles passing through each fixel: multi-bundle fixels (white) have multiple associated fibre bundles and single-bundle fixels have a singleassociated fibre bundle (orange). The bottleneck region, identified as the multi-bundle fixel where streamlines become indistinguishably mixed, generates falsepositive connection. As a result, a single FOD pattern can produce two probabilistic tractography outputs. b) ROIs relate to the functional representation of the trunk,arm and face regions shown for both medial and lateral parts of the two hemispheres. Tractography was seeded from the ROIs to reconstruct streamlines passingthrough the IC. c) The density map and (d) streamline projections are shown. The blue box indicates a zoomed region in (c) and the white box in (d) is the bottleneckregion of interest. The bottleneck problem is observed in the dMRI as streamlines from the ROIs are mixed. With the hybrid method, the streamlines from each ROIdemonstrate a clear anterior-posterior distribution in the bottleneck region. e) Fixel-based analysis was performed to generate a fixel density map for each ROI in theinternal capsule. The red, blue and green colours represent fixels associated with the trunk, arm and face regions respectively. Pink shows fixels associated with boththe trunk (red) and arm (blue) ROIs. Cyan shows the intersection of fixels from both the arm (blue) and face (green).

圖7. 混合纖維束成像保留內囊的局部解剖特征 a) 瓶頸問題。展示了內囊（IC）的一個示例（改編自席林等人，2022）。起源和終止于不同位置的兩束纖維在瓶頸區域以相似的方向匯聚（真實的軸突連接情況）。固定像素（每個體素的纖維方向，即fixel）根據穿過每個固定像素的纖維束數量進行分類：多纖維束固定像素（白色）有多個相關的纖維束，單纖維束固定像素有單個相關的纖維束（橙色）。瓶頸區域被識別為流線變得難以區分地混合的多纖維束固定像素區域，會產生假陽性連接。因此，單個纖維方向分布（FOD）模式可以產生兩種概率性纖維束成像輸出。 b) 感興趣區域（ROI）與兩個半球內側和外側部分所顯示的軀干、手臂和面部區域的功能表征相關。從感興趣區域（ROI）開始進行纖維束成像以重建穿過內囊的流線。 c) 顯示了固定像素密度圖，并且（d）顯示了流線投影。藍色框表示（c）中放大的區域，（d）中的白色框是感興趣的瓶頸區域。在擴散磁共振成像（dMRI）中觀察到瓶頸問題，因為來自感興趣區域（ROI）的流線是混合的。使用混合方法時，來自每個感興趣區域（ROI）的流線在內囊的瓶頸區域顯示出清晰的前后分布。 e) 基于固定像素（fixel）的分析被用于在內囊中為每個感興趣區域（ROI）生成固定像素密度圖。紅色、藍色和綠色分別代表與軀干、手臂和面部區域相關的固定像素。粉紅色表示與軀干（紅色）和手臂（藍色）感興趣區域（ROI）都相關的固定像素。青色表示來自手臂（藍色）和面部（綠色）的固定像素的交集部分。

Fig. 8. Hybrid tractography preserves topography in the brainstem.a) ROIs in the primary motor (blue) and somatosensory (red) cortex. Tractography was seeded from the ROIs to reconstruct streamlines passing through thebrainstem. b) The density map in sagittal view and (c) the streamline projections are shown. The blue box indicates a zoomed region in (b) and the white box in (c) isthe bottleneck region of interest. The bottleneck problem is observed in the 0.6 mm dMRI and 1 mm hybrid method as streamlines from the two ROIs are mixed. Inthe hybrid method at higher resolution (0.6 and 0.4 mm), the streamlines from each ROI demonstrate a separable distribution in the brainstem. d) Using fixel-basedanalysis, fixels from primary motor cortex (blue), somatosensory cortex (red), and overlapping fixels (pink) are shown.

圖8. 混合纖維束成像保留腦干的局部解剖特征 a) 初級運動皮層（藍色）和軀體感覺皮層（紅色）中的感興趣區域（ROI）。從感興趣區域（ROI）開始進行纖維束成像，以重建穿過腦干的流線。 b) 矢狀面的固定像素密度圖，以及（c）流線投影。藍色框表示（b）中放大的區域，（c）中的白色框是感興趣的瓶頸區域。在0.6毫米分辨率的擴散磁共振成像（dMRI）和1毫米分辨率的混合方法中可觀察到瓶頸問題，原因是來自兩個感興趣區域（ROI）的流線混合。在更高分辨率（0.6毫米和0.4毫米）的混合方法中，來自每個感興趣區域（ROI）的流線在腦干中呈現可分離的分布。 d) 采用基于固定像素（fixel）的分析方法，展示了來自初級運動皮層（藍色）、軀體感覺皮層（紅色）的固定像素，以及重疊的固定像素（粉紅色）。

Fig. 9. Comparisons of 0.6 mm hybrid and dMRI tractography to tracer data.a) The 91 cortical areas of M132 surface parcellation are shown for the left hemisphere. b) Weighted matrices of size 29 × 91 are shown for the tracer, dMRItractography, and hybrid tractography. c) An ROC curve illustrating the specificity and sensitivity of hybrid/diffusion-only tractography relative to the tracerconnectivity. Different thresholds were applied to the tractography ranging from 0 to 0.25 and the true positive and false positive rates were calculated. d) Binaryoverlap matrices for different tractography thresholds where tracer only connections are represented in blue (false negative), tractography only in yellow (falsepositive), and overlap in green (true positive and negative). False positive connectivity was counted for dMRI and hybrid tractography. e) Scatter plot comparingtracer data with tractography (both dMRI and hybrid dMRI-PLI). Tractography data were thresholded at 1e-4 and tracer data were thresholded at 1e-6. Correlationswere investigated for several different threshold for tractography (0.0005, 0.005, 0.05), producing similar results (data not shown). The red line denotes the leastabsolute residual fit, and ρ is the Pearson correlation coefficient. Data points on the x- and y- axis (x = 0 or y = 0) were excluded from the correlation analysis.

圖9. 0.6毫米混合纖維束成像、擴散磁共振成像（dMRI）纖維束成像與示蹤劑數據的比較 a) 展示了左側半球基于M132腦表面分區的91個皮質區域。 b) 示蹤劑、擴散磁共振成像（dMRI）纖維束成像以及混合纖維束成像的大小為29×91的加權矩陣。 c) 受試者工作特征（ROC）曲線，說明了混合纖維束成像/僅擴散磁共振成像纖維束成像相對于示蹤劑連接的特異性和敏感性。對纖維束成像應用了從0到0.25的不同閾值，并計算了真陽性率和假陽性率。 d) 不同纖維束成像閾值的二值重疊矩陣，其中僅示蹤劑連接用藍色表示（假陰性），僅纖維束成像連接用黃色表示（假陽性），重疊部分用綠色表示（真陽性和真陰性）。對擴散磁共振成像（dMRI）和混合纖維束成像統計了假陽性連接情況。 e) 示蹤劑數據與纖維束成像數據（包括擴散磁共振成像（dMRI）和混合磁共振成像-偏振光成像（dMRI-PLI））的散點圖。纖維束成像數據的閾值設為\(1\times10^{-4}\)，示蹤劑數據的閾值設為\(1\times10^{-6}\) 。針對纖維束成像的幾個不同閾值（0.0005、0.005、0.05）研究了相關性，得到了類似的結果（數據未展示）。紅線表示最小絕對殘差擬合，\(\rho\)是皮爾遜相關系數。坐標軸（\(x = 0\)或\(y = 0\)）上的數據點被排除在相關性分析之外。

Fig. 10. Multiple microscopy contrasts can inform hybrid tractography.Hybrid fibre orientation distributions reconstructed at 0.6 mm resolution from different microscopy contrasts: PLI, myelin- and Nissl-stained histology (Gallyassilver/Cresyl violet-stained). All three contrasts show fibre orientations aligned with neuroanatomical expectations. Noticeably, the histology FODs depict moremulti-fibre voxels (crossing fibre ratio = N**wm,multi? fibre/N**wm, voxels with fibre). These FODs can be fed into tractography to reconstruct white matter tracts (examplecorticospinal tract shown).

圖10. 多種顯微鏡成像對比度可為混合纖維束成像提供信息 從不同的顯微鏡成像對比度（偏振光成像（PLI）、髓鞘染色和尼氏染色組織學（加利亞斯銀染色/甲酚紫染色））以0.6毫米的分辨率重建的混合纖維方向分布。這三種對比度所顯示的纖維方向都符合神經解剖學預期。值得注意的是，組織學的纖維方向分布描繪出更多的多纖維體素（交叉纖維比率 = (N{wm, multi - fibre})/(N{wm, voxels with fibre})）。這些纖維方向分布可以輸入到纖維束成像中，以重建白質纖維束（如圖所示的皮質脊髓束的例子）。