? ? ? ? 關于雙熒光素酶報告基因檢測中遇到的問題及解決措施

問題1：為什么要用熒光素酶實驗來做檢測，不用其他報告基因來做，GFP可以嗎？

? ? ? ? 采用熒光素酶來做實驗是由其自身的優勢所決定的：（1）蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產生報告活性；（2）在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發光；（3）檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。以上優勢使其成為廣大科研工作者做相關驗證實驗的首選，其他報告基因由于種種缺陷一般不作為研究手段。

問題2：雙熒光素酶實驗為什么要加luciferase底物（luciferin）？

? ? ? ? 因為我們構建的雙熒光素酶系統是催化酶，要發光需要底物，催化酶催化底物才能產生熒光。

問題3：為什么要用兩個熒光素酶，海腎熒光素酶的作用是什么？

? ? ? ?通過利用熒光素酶與其底物結合發生的化學發光現象，可以將目標基因的調控序列克隆到螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）基因的上游，從而創建一個熒光素酶報告質粒。為了降低實驗中如細胞培養數量、活性差異，以及轉染和細胞裂解效率等內在變量對結果的影響，使用含有海洋蟲熒光素酶（Renilla luciferase）基因的質粒作為內部對照。這樣，通過共轉染這兩種報告基因到細胞中，可以確保獲得的轉錄活性數據更加穩定，減少實驗條件波動所帶來的影響。

問題4：轉染成功如何判斷？

? ? ? ? 在共轉染多個質粒的實驗中，通過測定最終的熒光素酶（luciferase）活性值，可以判斷3' UTR質粒和Renilla質粒的轉染效率。然而，對于miRNA質粒或miRNA模擬物（mimic），其轉染效果不能僅從熒光素酶讀數直接判斷。為了驗證miRNA的轉染效果，可以采取以下幾種方法：(1) 如果轉入的miRNA帶有如GFP等熒光標記，可在細胞裂解前通過顯微鏡觀察細胞內的熒光情況；(2) 若轉入的miRNA沒有熒光標記，則可以通過進行miRNA的定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測，比較實驗組與對照組中miRNA的表達差異，以此判斷其過表達情況；(3) 另外，可以設置一個帶熒光標記的質粒作為轉染效率的參照，與目標細胞同時進行轉染，從而間接評估整個實驗批次中的轉染效率。

問題5：如何判斷實驗體系無異常？

? ? ? 可以從以下幾個方面來考察實驗結果的客觀性：

? ? ? 對照的2個實驗組，即實驗組1與實驗組2 luc表達情況應無顯著差異；轉染正常，質粒或mimic確保成功轉染入細胞；luc檢測值在儀器檢測線性范圍內。

問題6：陰性結果如何理解？

? ? ? ? 在確保實驗體系無異常的前提下，如果最終檢測到的結果是陰性結果，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調控靶基因的表達，可再做一次

問題7：實驗體系是否可以優化？

? ? ? ? 該實驗的關鍵點在細胞狀態和轉染效率，轉染效率的優化可通過調整共轉染質粒的比例或調整轉染體系來進行，設置合理的質粒轉染量梯度，觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應或是否存在變化趨勢的一致性，從而使結論更加可靠。

問題8：使用mimics的一些問題？

? ? ? ?可以使用mimics來做實驗，其實mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉錄，用qRT-PCR來檢測表達量，但是大家應該很少看到有文章把mimics的過表達量PCR結果放出來的吧，那是因為mimics的過表達通常在數萬到數十萬倍，miIRNA通常會靶向結合許多靶基因，這么強的外源過表達肯定會引起嚴重的脫靶效應，給審稿人把柄質疑你嗎？對于這種找抽的行為大家肯定是積極規避的。質粒介導的miRNA過表達由于是模擬了前體在生物體內的剪切，其過表達通常在數十倍到數百倍，可能引起的脫靶效應遠沒有mimics嚴重。

問題9：其他調控方法

? ? ? ?是否還有其他方法驗證miRNA對靶基因表達的調控？驗證miRNA對靶基因的調控，也可直接檢測miRNA過表達或下調表達后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（Western Blot方法）。

問題10：關于熒光的問題-熒光值過高

? ? ? ?熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

1.減少質粒轉染量；

2.細胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或對裂解產物進行稀釋后檢測。

（注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結果出現大的偏差。）

問題11：雙熒光素酶的最終數值怎么處理？

? ? ? ?通常比較雙熒光素酶各組的數值，是需要對螢火蟲熒光檢測的數值和海腎熒光進行歸一化反應，歸一化反應的計算數值為兩者的比值。

? ? ? 卡梅德生物（KMD Bioscience）建立了完善的細胞培養平臺，能夠提供給客戶多種細胞學基礎實驗，可以提供優質的免疫檢測服務—雙熒光素酶標記基因檢測。

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