分枝生長是作物農業特性中的一項重要指標，它直接影響植株的結構和作物的產量。黃瓜（學名：Cucumis sativus?L.）是一種在全球范圍內具有重要經濟價值和營養價值的重要蔬菜作物。在田間環境中，具有更多側枝的黃瓜植株更受青睞以提高產量。雖然光敏色素B（phyB）、分枝蛋白1（BRC1）和脫落酸（ABA）能夠促進腋芽的生長，但目前尚不清楚植物界中是否存在它們之間的整合因子。

基于此，近日中國農業大學張小蘭/趙劍宇團隊于JIPB上發表了一篇名為“The CsphyB-CsPIF4-CsBRC1 module regulates ABA biosynthesis and axillary bud outgrowth in cucumber”的文章，本文結合轉錄組、ChIP-seq、酵母雙/單雜、雙熒光素酶等實驗發現了一個涉及CsphyB-CsPIF4-CsBRC1的調控網絡，該網絡整合了光信號和ABA生物合成來調節側芽生長。這為作物育種中對分支數量的調控提供了一種策略，從而能夠實現理想的分支特性，進而最大限度地提高產量。愛基百客為本研究提供了ChIP-seq的技術服務。

圖1CsphyB-CsPIF4-CsBRC1調節ABA合成與黃瓜側芽伸長的工作模型

? ?結果展示 ??

一.?CsphyB能夠促進黃瓜腋芽的生長

在之前的研究中，近等基因系（NIL）-lh1（其在CsphyB基因中存在一個7個堿基的缺失，導致生成的蛋白質僅含有79個氨基酸殘基）在幼苗階段與野生型（WT）Gy14相比表現出額外長的下胚軸。對成年植株的表型特征分析顯示，CsphyB突變體（NIL-lh1）的側枝明顯更少且更短，但腋芽的啟動未受影響。Gy14的腋芽逐漸伸長以形成分支，但NIL-lh1植株每個節點的枝條長度大幅縮短，并且沒有可處理的側枝（基于農業標準為長度超過4厘米的側枝）。此外，對野生型PS76進行CsphyB突變呈現出與NIL-lh1一致的表型，確定了CsphyB的功能破壞極大地阻礙了黃瓜腋芽的生長。

圖2Gy14（WT）和近等基因系（NIL）-lh1的表型特征分析

二. 遮光處理會抑制黃瓜的側芽生長

遮陰處理會導致遮陰逃避綜合征，表現為胚軸和側枝的伸長增加、側枝分支減少以及葉片面積減小。為了探究光信號如何調節黃瓜的側枝發育，作者對側枝過多的Sikkim inbred line WI7120進行了遮陰處理。遮陰極大地抑制了WI7120中花芽的生長，并且增加了節間長度，表明遮光抑制了黃瓜的側芽生長。

圖3遮光處理會阻礙WI7120側枝的生長

三. 脫落酸的生物合成途徑與黃瓜中由CsphyB介導的莖枝分枝現象有關

為了確定黃瓜中CsphyB的下游靶點及其調控網絡，作者使用來自Gy14和NIL-lh1同一節點的側芽進行了轉錄組測序分析。DEG分析與RT-qPCR結果顯示CsBRC1（CsGy1G003520，一種抑制黃瓜側枝生長的關鍵抑制因子），CsNCED3（CsGy4G007460）、CsNCED5（CsGy6G035690）和CsNCED6（CsGy2G009810）（三個ABA生物合成基因）在NIL-lh1中顯著上調表達。由于NCEDs在ABA生物合成的限速步驟中起作用，作者測量了Gy14和NIL-lh1同一節點側芽中的ABA含量，發現Gy14中ABA的平均濃度低于NIL-lh1，表明ABA的生物合成過程參與了黃瓜植株中由CsphyB誘導的分枝現象。

在這三種差異表達的CsNCED蛋白中，只有CsNCED3在Gy14的側芽中表達水平較高。因此，作者重點研究了CsNCED3。通過分析CsNCED3的啟動子，作者發現了一個可能的順式作用元件作為CsBRC1的結合位點。為了探究CsBRC1是否能直接調控黃瓜中CsNCED3的表達，作者使用雙熒光素酶報告系統、EMSA體外實驗進行了轉錄激活實驗驗證。為了進一步驗證CsBRC1在體內的與CsNCED3啟動子的結合，作者生成了表達35S：CsBRC1-Flag構建體的轉基因黃瓜系。染色質免疫沉淀測序（ChIP-Seq）分析顯示，在CsNCED3啟動子區域存在兩個CsBRC1結合峰，這些峰涵蓋了P1轉座子元件。這些結果有力地證明了在黃瓜體內，CsBRC1直接與CsNCED3啟動子結合。這些發現表明CsphyB可能通過CsBRC1介導的ABA生物合成來調控黃瓜的側枝生長。

圖4黃瓜中CsphyB可能通過ABA途徑來調控黃瓜的側芽生長

四. CsPIF4與CsphyB相互作用，并直接促進CsBRC1的表達

在擬南芥中，phyB在吸收紅光后會從無活性形式轉變為有活性形式，并進入細胞核。前期研究中，黃瓜CsphyB在紅光下定位在細胞核內，并與CsPIFs相互作用。為了確認黃瓜中CsphyB與CsPIFs之間的相互作用，作者通過同源性比對搜索鑒定出了七個CsPIFs。酵母雙雜交（Y2H）實驗表明，CsPIF1a、CsPIF1b、CsPIF3和CsPIF4能夠與CsphyB相互作用，而分裂熒光素酶互補實驗驗證了CsphyB與CsPIF3/4在蛋白質水平上的相互作用。

為了探究CsPIFs是否能夠直接與CsBRC1結合，作者分析了CsBRC1起始密碼子上游的2000個堿基對的啟動子區域，并識別出了七個E-box元件，其中包括兩個典型的G-box元件（CACGTG）。酵母單雜、EMSA、雙熒光素酶實驗結果顯示只有CsPIF4能夠與CsBRC1的P1和P6轉錄激活元件結合。為了驗證CsPIF4與CsBRC1啟動子在體內的相互作用，作者生成了一個含有35S：CsPIF4-Flag構建體的轉基因黃瓜植株，并進行了ChIP實驗。染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）的結果顯示，CsPIF4在CsBRC1的啟動子區域存在一個結合峰，該啟動子區域包含了P6順式元件。這些結果表明，CsPIF4能夠直接與CsBRC1的啟動子結合并增強其表達。

圖5CsPIF4直接與CsBRC1結合，從而激活其表達

五.?CsPIF4的功能障礙導致黃瓜側枝生長增多

為了探究CsPIF4在黃瓜中的生物學功能，作者利用CRISPR/Cas9系統生成了Cspif4突變體。獲得了兩個純合突變株，即Cspif4#1（存在84個堿基對的缺失）和Cspif4#3（存在1個堿基對的缺失），這兩個突變株分別導致蛋白質提前終止，長度分別為5個和49個氨基酸。表型特征表明，這兩個突變株的側枝數量、芽生長比例、節間分支長度均多于野生型（“9930”背景）。與野生型相比，Cspif4突變體腋芽中的CsBRC1和CsNCED3的表達水平降低，Cspif4#1突變體中的ABA濃度顯著降低。這些結果表明，CsPIF4通過刺激CsBRC1的表達和促進黃瓜中ABA的生物合成來抑制側枝的生長。

圖6黃瓜植株中CsPIF4的缺失會導致側芽的生長量增加

六.?Csnced3突變體中脫落酸的缺乏會促進側芽的生長

為了探究黃瓜中ABA積累量減少與芽生長加快之間的遺傳關系，作者利用CRISPR/Cas9技術培育了兩個Csnced3突變株系。Csnced3#1存在一個7個堿基的缺失，而Csnced3#2在第一個靶位點處存在一個1個堿基的插入；這兩種突變均導致CsNCED3蛋白翻譯的提前終止。表型分析顯示，這兩個Csnced3突變株系的側枝數量、長度，芽生長比例、均顯著大于野生型（R1461背景）。對側芽中ABA含量的進一步分析顯示，與野生型相比，Csnced3突變體中的ABA含量顯著降低。這些結果表明，Csnced3突變體中降低的ABA水平促進了側芽的生長，這表明ABA在黃瓜的側枝生長中起著負面作用。

圖7黃瓜中CsNCED3的缺失導致黃瓜側芽的生長量增加

? ?總 ?結 ??

本研究以黃瓜為對象，聚焦研究了光信號與激素調控側芽萌發的分子機制。作者利用轉錄組、ChIP-seq、酵母雜交、雙熒光素酶報告基因、EMSA等實驗結合表型實驗挖掘了“CsphyB-CsPIF4-CsBRC1-ABA”的調控網絡，闡明該模塊通過整合光信號與ABA合成調控側芽萌發的機制，為作物分枝性狀改良提供育種策略。

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