GuPPy-v1.2.0安裝與使用-生信工具52

GuPPy：Python中用于光纖光度數據分析的免費開源工具

?01 背景

Basecalling 是將原始測序信號轉換為堿基序列的過程，通俗地說，就是“把堿基識別出來”。這一過程在不同代測序技術中各不相同：

一代測序是通過解析峰圖實現；
二代測序則是對熒光圖像進行處理；
而三代測序中的 Nanopore 技術 則是通過電信號，即電流強度的變化，來推斷通過納米孔的堿基。

由于每次測量的是多個堿基的疊加信號，識別過程更為復雜。因此，堿基識別算法仍在不斷發展和優化中。

目前，Oxford Nanopore Technologies (ONT) 官方推薦的 basecalling 工具是 Guppy。在此之前曾使用過 Albacore，后續還有可能被更新的工具（如 Flappie）所替代。這也從側面反映出該領域仍有廣闊的優化空間，是當前測序研究的重要方向之一。

盡管存在如 poretools、nanopolish 等多種第三方工具，但在 basecalling 任務中，仍建議首選官方工具。畢竟，硬件由 ONT 提供，他們對信號特征的理解更加深入。此外，Nanopore 的 basecalling 與所用芯片類型密切相關，例如：

DNA 分子在納米孔中以約 450 bp/s 的速度通過；
RNA 分子則較慢，約為 70 bp/s。

這一差異也決定了其識別算法存在本質上的不同。

Guppy 簡介

Guppy 是 Oxford Nanopore 官方提供的堿基識別軟件，是一個基于命令行的工具。

Guppy 主要包含以下幾項核心功能：

堿基識別
Guppy 的核心功能是將電流信號轉換為 DNA 或 RNA 堿基序列。其底層算法基于循環神經網絡（RNN），可以準確識別五種標準堿基：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）以及尿嘧啶（U）。
條形碼拆分（Demultiplexing）
如果文庫構建中添加了條形碼（barcode），Guppy 可自動識別兩端的條碼序列，并將樣本數據進行拆分。這一過程類似于 Illumina 測序中基于 index 的樣本區分。
參考序列比對
Guppy 支持將識別后的堿基序列與參考基因組進行比對，底層實際上調用的是 minimap2 工具。由于該功能中 minimap2 的參數設置是內嵌的，不可調整，建議用戶在比對任務中使用獨立的 minimap2 工具，以確保更高的靈活性與精度。
甲基化修飾檢測
Guppy 還具備一定的堿基修飾檢測能力。當堿基發生如甲基化等修飾時，其通過納米孔時的電信號會表現出異常。Guppy 可通過識別這些“離群”信號推測潛在修飾位點。
目前該功能仍依賴于特定的訓練數據集，支持的物種有限（如大腸桿菌、人類等模式生物）。若對特定物種感興趣，可嘗試構建定制訓練集進行檢測。

https://github.com/LernerLab/GuPPy   #官網
wget -c https://github.com/LernerLab/GuPPy/archive/refs/tags/v1.2.0.zip    #new version

02下載

下載 GuPPy 代碼

a. 點擊頁面右上角綠色的 “Code” 按鈕，會彈出下拉菜單。
b. 點擊 “Download ZIP” 下載壓縮包（注意：請保存在本地硬盤中，不要保存在iCloud、OneDrive、Box等云端，建議保存至 C盤 用戶文件夾）。
c. 解壓下載的ZIP文件，得到文件夾 “GuPPy-main”，并將其放在一個方便的位置（避免使用云同步文件夾）。
d. 記下 “GuPPy” 子文件夾的路徑，在后續操作中會用到。

Mac：右鍵文件夾 → 點擊“顯示簡介” → 查看“位置”字段
Windows/Linux：右鍵文件夾 → 屬性 → 查看“位置”字段
示例：/Users/LernerLab/Desktop/GuPPy-main

`03 安裝`

conda安裝

cd 路徑_to_GuPPy_folder
示例：cd /Users/LernerLab/Desktop/GuPPy-main創建并激活 GuPPy 環境
依次輸入以下命令：注意：filename 替換為你的系統對應的配置文件：Windows: spec_file_windows10.txtMac: spec_file_mac.txtLinux: spec_file_linux.txtconda create --name guppy --file filename
conda activate guppy

04 使用

啟動 GuPPy 用戶界面
輸入以下命令以啟動GUI界面：panel serve --show GuPPy/savingInputParameters.ipynb
此時，GuPPy 已成功安裝并可開始使用！卸載 GuPPy
若需卸載：conda remove --name guppy --all

05 官方教學視頻

Installation steps
Explaining Input Parameters GUI
Individual Analysis steps
Artifacts Removal
Group Analysis steps
Use of csv file as an input
Use of Neurophotometrics data as an input

06 官方示例數據

Sample data?for the user to go through the tool in the start. This folder of sample data has two types of sample data recorded with a TDT system : 1) Clean Data 2) Data with artifacts (to practice removing them) 3) Neurophotometrics data 4) Doric system data. Finally, it has a control channel, signal channel and event timestamps file in a 'csv' format to get an idea of how to structure other data in the 'csv' file format accepted by GuPPy.

?07 常用 Basecall

7.1 基本命令格式

通過 guppy_basecaller -h 可查看工具的基本使用方式：

guppy_basecaller -i <輸入路徑> -s <輸出路徑> -c <配置文件> [options]

常用參數說明：

-i：輸入文件夾（包含 .fast5 文件）
-s：輸出文件夾（保存 fastq 或 bam 文件）
--config：指定 basecall 配置文件
-r / --recursive：遞歸處理子目錄
--flowcell：芯片類型（如 FLO-MIN106、FLO-MIN107）
--num_callers：并行處理數（通常影響輸出文件數量）
--cpu_threads_per_caller：每個 caller 使用的 CPU 線程數
--compress_fastq：輸出壓縮格式的 fastq 文件
-q：每個輸出文件中包含的最大讀段數（設為 0 表示每個讀段單獨輸出）
--disable_qscore_filtering：禁用質量分數過濾，保留低質量讀段
--align_ref：參考基因組 FASTA 或索引文件
--model_file：指定模型文件
--device / -x：設置使用的 GPU（如 cuda:0、cuda:1,2 或 auto）
--bed_file：指定包含感興趣區域的 .bed 文件
--align_type：設置比對模式（auto、full 或 coarse）
--minimap_opt_string：傳遞 minimap2 的自定義參數
--bam_out：輸出 BAM 格式文件
--index：生成 BAM 索引
--moves_out：在 BAM 文件中輸出堿基移動信息

7.2 使用配置文件 (`-c`) 進行 Basecall

最基礎的 basecall 命令如下，可按需調整參數：

guppy_basecaller \-i fast5_files/ \-s output/ \--config dna_r9.4.1_450bps_sup.cfg \--model_file $HOME/bio/tools/ont-guppy-cpu/data/template_r9.4.1_450bps_hac.jsn \--disable_qscore_filtering \-r \--align_ref refs/dna.fa

7.3 通過 Flow Cell 和 Reagent Kit 指定模型

若未使用 --config 指定模型，可通過 flow_cell 和 kit 參數自動選擇合適配置。

查看支持的芯片和試劑盒：

?guppy_basecaller --print_workflows

過濾特定組合（例如：FLO-MIN106 與 SQK-LSK109）：

?guppy_basecaller --print_workflows | grep FLO-MIN106 | grep SQK-LSK109

示例輸出：

?FLO-MIN106  SQK-LSK109  dna_r9.4.1_450bps_hac  2021-05-17_dna_r9.4.1_minion_384_d37a2ab9

使用該組合進行 basecall：

guppy_basecaller \-i fast5_files/ \-s output/ \--flowcell FLO-MIN106 \--kit SQK-LSK109 \--model_file $HOME/tools/ont-guppy-cpu/models/template_r9.4.1_450bps_hac.jsn

7.4 使用自定義模型進行 Basecall

如使用自定義訓練模型（如 Taiyaki 訓練的模型）：

導出模型為 JSON 格式：

dump_json.py training/model_final.checkpoint > model.json

使用該模型進行 basecall：

可結合 Guppy + Megalodon 等工具進行堿基修飾檢測（如甲基化）等！

08 引用

Venus N. Sherathiya, Michael D. Schaid, Jillian L. Seiler, Gabriela C. Lopez, and Talia N. Lerner GuPPy, a Python toolbox for the analysis of fiber photometry data. Sci Rep 11, 24212 (2021).?GuPPy, a Python toolbox for the analysis of fiber photometry data | Scientific Reports