在生命科學領域，蛋白質間的相互作用構成了生命活動的核心網絡，驅動著信號傳導、基因調控、代謝途徑等關鍵過程。為了繪制這幅復雜的“分子互作地圖”，科學家們開發了多種技術，其中免疫共沉淀結合質譜（IP-MS）、Pull down結合質譜（Pull down-MS）以及近年興起的鄰近標記技術（如BioID、APEX）是核心利器。本文將對這三種技術進行詳細比較，幫助大家了解它們的優缺點及適用場景。
IP-MS
IP-MS利用目標蛋白（誘餌蛋白）的特異性抗體，在接近生理條件的細胞裂解液中捕獲誘餌蛋白，將與誘餌蛋白直接或間接穩定結合的蛋白（獵物蛋白）富集后進行質譜鑒定，從而確定與目標蛋白存在相互作用的潛在蛋白。
實驗流程
1、載體構建及細胞轉染（如有內源抗體則可省略該步驟）；
2、細胞裂解與抗體孵育；
3、磁珠捕獲免疫復合物；
4、洗滌并洗脫免疫復合物；
5、質譜鑒定和數據分析。
技術優勢
1、體內生理條件下互作檢測和篩選；
2、無需蛋白純化過程，操作簡單；
3、可結合多種處理研究相互作用。
技術缺點
1、對抗體質量依賴高，抗體質量決定實驗成敗；
2、背景噪音較高，靈敏度低，容易出現假陽性；
3、無法檢測弱/瞬時相互作用，并且無法區分直接或間接相互作用；
4、不具備空間分辨率，無法準確定位互作動態變化。
應用案例
2024年3月，浙江大學醫學院宋朋紅課題組在《Cancer Commun (Lond).》雜志發表題為“SERPINE2 promotes liver cancer metastasis by inhibiting c-Cbl-mediated EGFR ubiquitination and degradation”的研究論文。該團隊利用IP-MS檢測證實，SERPINE2通過與EGFR相互作用激活表皮生長因子受體（EGFR）及其下游信號通路。在機制上，SERPINE2通過與 E3 泛素連接酶 c-Cbl 競爭來抑制 EGFR 泛素化并維持其蛋白質穩定性。此外，索拉非尼治療后肝癌細胞中的EGFR被激活，敲低誘導的EGFR下調SERPINE2顯著增強了索拉非尼對肝癌的治療效果。此外，作者還發現SERPINE2敲低對樂伐替尼治療也有致敏作用。
Pull down MS
Pull down-MS與IP-MS類似，核心也是捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白，區別在于捕獲方式不是使用抗體，而是使用與誘餌蛋白融合表達的標簽蛋白（如GST, His, MBP等）或固定化的生物分子配體（如固定化的GTP用于捕獲Rho GTPase）進行互作蛋白捕獲。
實驗流程
1、誘餌融合蛋白表達載體構建；
2、融合蛋白表達純化；
2、細胞裂解與融合蛋白共孵育；
3、磁珠捕獲免疫復合物；
4、洗滌并洗脫免疫復合物；
5、質譜鑒定和數據分析。
技術優勢
1、體外直接篩選互作蛋白；
2、無需IP級別抗體；
3、洗脫純度高，信噪比高。
技術缺點
1、體外篩選，無法反應真實生理情況；
2、需要構建融合蛋白，標簽可能影響蛋白結構和表達；
3、需要進行蛋白純化，受純化質量影響大；
4、不具備空間分辨率，無法準確定位互作動態變化。
應用案例
2023年8月，廣東藥科大學李雄課題組在《J Exp Clin Cancer Res》雜志發表題為“AR antagonists develop drug resistance through TOMM20 autophagic degradation-promoted transformation to neuroendocrine prostate cancer”的研究論文。該團隊證實 TOMM20的蛋白水平與PCa細胞和標本中的AR呈正相關。TOMM20蛋白與AR發生物理相互作用，AR拮抗劑通過自噬-溶酶體途徑誘導TOMM20的蛋白質降解，從而提高細胞內ROS水平，激活PI3K/AKT信號通路。當TOMM20耗盡時，PCa細胞接受EMT，獲得癌癥干細胞樣細胞的特征，并對AR拮抗劑產生耐藥性。TOMM20的穩定耗竭促進了PCa腺癌向NEPC的轉分化和轉移。相反，TOMM20的搶救使耐藥PCa細胞對AR拮抗劑重新敏感。
?鄰近標記技術
鄰近標記技術（Proximity labeling，PL）是將具有連接酶活性的酶與目的蛋白融合, 在連接酶的催化作用下將小分子底物連接到與目的蛋白鄰近的內源蛋白或核酸分子，通過小分子底物富集蛋白或核酸分子，實現篩選潛在互作蛋白或核酸的目的。
實驗流程
1、鄰近標記酶融合誘餌蛋白表達質粒構建；
2、細胞培養和質粒轉染；
3、底物分子（通常為生物素）標記；
4、細胞裂解并與磁珠共孵育；
5、洗滌并洗脫免疫復合物；
6、質譜鑒定和數據分析。
技術優勢
1、體內生理環境篩選互作蛋白；
2、洗脫強度大，信噪比高；
3、不依賴IP級別的抗體和體外純化的蛋白；
4、具有空間分辨率，能夠檢測分子間的動態相互作用；
5、能夠實現原位標記，分析互作的空間性；
6、能夠檢測瞬時相互作用或弱相互作用；
技術缺點
1、過氧化物酶對細胞具有一定毒害作用；
2、標記范圍有限，并且可能存在非特異性標記；
3、需要對目的蛋白融合鄰近標記酶，可能影響目的蛋白表達或構象；
應用案例
2025年1月，中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室龐濤課題組在《Acta Pharm Sin B》雜志發表題為“The PGAM5-NEK7 interaction is a therapeutic target for NLRP3 inflammasome activation in colitis”的研究論文。該研究團隊證實小鼠敲除PAGM5基因能夠通過抑制NLRP3炎癥小體的激活改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎。借助基于APEX2的鄰近標記與定量蛋白質組學，作者確定了有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶NEK7是PGAM5新的結合蛋白，能夠促進以PGAM5磷酸酶活性非依賴性介導的NLRP3炎癥小體的組裝和活化。使用安石榴素處理則能夠干擾PGAM5-NEK7的相互作用，從而抑制巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的活化并改善DSS誘導的小鼠結腸炎。
?如何選擇？
1.研究強而穩定的復合物成員，且有高質量抗體時， IP-MS 可能是直接有效的選擇。
2.需要嚴格驗證誘餌與獵物是否直接結合時，體外 Pull down-MS 結合生物物理驗證是最佳途徑。
3.探索未知的、特別是弱/瞬態/依賴于細胞環境的互作網絡時，鄰近標是首要選擇。
4.需要高時空分辨率如信號通路快速響應時，鄰近標記技術是唯一選擇。
5.研究特定亞細胞區域（如細胞器、膜接觸位點）的蛋白質組時，鄰近標記是首要選擇。
參考文獻
[1] Zhang S, Jia X, Dai H, et al. SERPINE2 promotes liver cancer metastasis by inhibiting c-Cbl-mediated EGFR ubiquitination and degradation [J].?Cancer Commun (Lond), 2024, 44(3):384-407.
[2] Yin L, Ye Y, Zou L, et al. AR antagonists develop drug resistance through TOMM20 autophagic degradation-promoted transformation to neuroendocrine prostate cancer [J].?J Exp Clin Cancer Res, 2023, 42(1):204.
[3] Gao C, Song J, Wang H, et al. The PGAM5-NEK7 interaction is a therapeutic target for NLRP3 inflammasome activation in colitis [J].?Acta Pharm Sin B,?2025, 15(1):349-370.
