目標
DNA染色（如間接Hoechst染色技術）一種快速的方法，其可在72小時內獲得結果，這相較于通過培養分離檢測支原體所需的4周時間相比是更加有利的。用DNA染色劑對細胞系進行直接染色可在24小時內獲得結果，但會大大降低靈敏度（~106?cfu/mL）。這一問題可以通過將指示細胞系（如Vero）與試驗細胞系共培養來改善。該富集步驟可獲得100?cfu/mL培養物的靈敏度，并且是ECACC使用的優選方法。該步驟還可通過增加支原體可粘附的表面積來提高靈敏度。與通過培養進行檢測一樣，DNA染色法適用于從細胞培養物或細胞培養試劑中對支原體進行檢測。
產品列表
- 細胞培養基?—?預熱到適當的溫度（有關正確的培養基和溫度，請參閱ECACC細胞系數據表。）
- 甲醇（Sigma-Aldrich 322415）
- 冰醋酸（Sigma-Aldrich A6283）
- Hoechst?33342染色液（Sigma-Aldrich B2261)
- 指示細胞如Vero細胞（84113001）豬鼻支原體?NCTC10130和口腔支原體?NCTC?10112
設備
- 個人防護裝備（無菌手套、實驗室外套、護目鏡）
- 水浴溫度設定為37 °C
- 具有防護等級的微生物安全柜
- CO2培養箱溫度設定為37 °C
- 顯微鏡（紫外線外落射熒光）
- 組織培養皿
- 多培養皿12孔板
- 顯微鏡載玻片和13mm蓋玻片
- 鋁箔
操作流程
- 將無菌蓋玻片置于組織培養皿/板（例如12孔板）中。
- 將2mL的指示細胞接種至準備好的培養皿中，例如12孔板每孔接種2×104?Vero細胞。
- 在37°C，5％ CO2條件下孵育2-24小時，使細胞粘附在蓋玻片上。
- 使用細胞刮刀將附著的測試細胞系置于懸浮液中。懸浮細胞系可進行直接檢測。
- 從重復的培養皿中移除1mL培養物上清液，并向每個重復中加入1mL測試細胞樣品。用100 cfu的每個陽性對照樣品接種于2孔中。
- 將未接種的重復組織培養孔留作陰性對照。
- 將培養皿在37 °C，5％ CO2中孵育3-5天。
- 3-5天后，通過向每個培養皿中加入至少2 mL新鮮制備的Carnoy's固定液（冰醋酸：無水甲醇=1：3）并保持3分鐘，從而將細胞固定于蓋玻片上。然后將固定液倒入有毒廢物瓶中。重復一次該步驟。加入至少2mL Hoechst染色液（0.4μg/nl）。靜置3分鐘，避免光直射（如用鋁箔覆蓋）。
- 將使用和未使用的染色液倒入有毒廢物瓶中。
- 將1滴封固劑加入預先標記的顯微鏡載玻片中，并將蓋玻片（細胞側朝下）置于載玻片上。
- 保持載玻片用鋁箔覆蓋，并將其放置在37 °C下至少15分鐘或在室溫下放置30分鐘。
- 在100倍的紫外落射熒光下觀察載玻片。
有效結果的標準
陰性對照顯示無支原體感染；陽性對照顯示支原體感染；Vero細胞可通過發熒光的細胞核清楚的觀察到。
陽性結果的標準
感染支原體的樣品表現為：熒光細胞核，和支原體DNA（小球菌或細絲）的核外熒光。
陰性結果的標準
未感染的樣品表現為：深色背景下發熒光的細胞核。應沒有支原體的熒光證據，即支原體DNA的核外熒光。
注意
- DNA染色劑（如Hoechst染色劑）能與DNA特異性地結合。在所有培養物中，細胞核都會發生熒光。理論上，未污染的培養物僅顯示出熒光核，而支原體陽性培養物則含有小的球菌或細胞，其可能吸附或未吸附于細胞上（圖11）。但請注意，任何外來的DNA也可能產生熒光，例如細胞碎片 - 其有時會被誤認為是支原體污染。
- Hoechst染色劑具有毒性，應小心處理和丟棄。
- 在某些情況下，結果可能難以解釋，其原因可能為：
? 細菌/酵母/真菌污染
? 背景中碎片過多（如在如雜交瘤細胞系中）
? 因細胞全部死亡而導致的破裂細胞核
? 活細胞過少或沒有 - 盡管該實驗步驟建議使用陽性對照，但在資源有限的細胞培養設施中這可能是不可取的或不一定是可行的。如果要使用陽性對照，則應在與主要組織培養設施不同的實驗室中進行。如果沒有使用陽性對照，強烈建議您到獨立的測試實驗室定期測試您的細胞系。
- ECACC建議使用至少兩種檢測方法（例如間接DNA染色和培養物分離）對樣品進行支原體檢測，以獲得更可靠的結果。這是由于不同種類的支原體對方法的檢測靈敏度可能不同。
ECACC提供支原體檢測服務，并可提供三種不同的檢測方法：PCR、間接DNA染色和培養物分離。
