前言

**sORF（small Open Reading Frame，小開放閱讀框）**在基因組中廣泛存在，越來越多研究發現它們具有重要的生物學功能。如何判斷一個sORF是否具有編碼蛋白的潛能？**CPAT（Coding Potential Assessment Tool）**是目前主流的編碼潛能預測軟件之一。本文將手把手教你如何用CPAT預測sORF的編碼潛能，適合Ribo-seq、轉錄組等多種場景。

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一、準備工作

1. 安裝CPAT

CPAT支持Python 2和3，推薦用conda安裝：

conda create -n cpat python=3.8
conda activate cpat
pip install CPAT

或直接用pip：

pip install CPAT

2. 下載物種特異性模型

CPAT需要物種特異性的訓練模型。人、小鼠、斑馬魚等常見物種可在CPAT官網下載。
如需自建模型，可參考官方文檔。

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二、準備sORF核酸序列

1. 獲取sORF的拼接核酸序列

• 注意：CPAT的輸入必須是拼接后的ORF核酸序列（即mRNA區段），不能直接用基因組區間！
• 推薦流程：
  1. 用RiboCode等工具注釋sORF，獲得GTF和外顯子區間，參照文章 2025.06.11【Ribo-seq】|根據注釋文件獲取外顯子及ORF序列
  2. 用bedtools和Python腳本拼接外顯子，得到每個sORF的完整核酸序列（FASTA格式）。

示例腳本（假設已獲得外顯子fasta）：

from Bio import SeqIO
from collections import defaultdict
import reexon_seqs = list(SeqIO.parse("orf_exons.fa", "fasta"))
orf_exons = defaultdict(list)
for record in exon_seqs:m = re.match(r"(.+?)::(.+?):(\d+)-(\\d+)\\(([-+])\\)", record.id)if not m:continueorf_id, chrom, start, end, strand = m.groups()start = int(start)orf_exons[(orf_id, strand)].append((start, record.seq))with open("orfs.fa", "w") as out:for (orf_id, strand), exons in orf_exons.items():exons.sort(reverse=(strand == "-"))seq = "".join(str(seq) for _, seq in exons)if len(seq) < 300:  # 只保留小于300nt的sORFout.write(f">{orf_id}\\n{seq}\\n")

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三、運行CPAT預測編碼潛能

1. 準備CPAT模型和hexamer表

以人類為例，假設模型和hexamer表為：

• Human_logitModel.RData
• Human_Hexamer.tsv

2. 運行CPAT

cpat.py -g orfs.fa \-d Human_logitModel.RData \-x Human_Hexamer.tsv \-o cpat_result.txt

參數說明：

• -g：輸入的sORF核酸序列（FASTA格式）
• -d：物種特異性模型
• -x：hexamer表
• -o：輸出結果

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四、結果解讀

輸出文件cpat_result.txt包含如下主要字段：

ID	mRNA_size	ORF_size	Fickett_score	Hexamer_score	Coding_prob
…	…	…	…	…	…

• Coding_prob：編碼潛能概率，越接近1越可能編碼蛋白。
• 一般閾值：人類推薦0.364，具體可參考CPAT官方或文獻。

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五、常見問題與排查

1. 報“No ORFs found for …”怎么辦？

• 檢查輸入序列是否為拼接后的ORF區段，且包含ATG起始和終止密碼子。
• 檢查FASTA格式是否正確。
• 檢查序列是否過短或有N等不明堿基。

2. 可以直接用基因組區間序列嗎？

不可以！
必須用拼接后的ORF核酸序列，否則會混入內含子，導致預測結果不準確。

3. 如何批量篩選高編碼潛能的sORF？

awk '$6 > 0.364' cpat_result.txt > cpat_high_coding.txt

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六、總結

• CPAT是sORF編碼潛能預測的利器，但輸入必須是拼接后的ORF核酸序列。
• 推薦結合RiboCode、bedtools、Python腳本等工具，批量提取sORF序列。
• 結果需結合生物學背景和其他證據綜合判斷。

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