Two BAHD Acyltransferases Catalyze the Last Step in the Shikonin/Alkannin Biosynthetic Pathway

兩個BAHD酰基轉移酶催化了紫草素/左旋紫草素生物合成途徑中的最后一步

一個BAHD酰基轉移酶專門催化紫草素的酰基化，而另一個BAHD酰基轉移酶則僅催化紫草素的對映體左旋紫草素的酰基化，這種現象發生在紫草（Lithospermum erythrorhizon）中

摘要

一些紫草科植物會生成具有生物活性的紅色萘醌類色素，這些色素是紫草素和左旋紫草素（對映異構體）的衍生物，其側鏈上的酰基種類各不相同。不同植物種類中紫草素/左旋紫草素衍生物的組成存在差異，但關于形成這些衍生物多樣性的機制尚不清楚。本研究從紫草（Lithospermum erythrorhizon）中鑒定并表征了兩種BAHD酰基轉移酶：紫草素O-酰基轉移酶（LeSAT1）和左旋紫草素O-酰基轉移酶（LeAAT1）。紫草是一種紫草科的藥用植物，主要生成紫草素/左旋紫草素衍生物，如乙酰紫草素和β-羥異戊酰紫草素。通過使用大腸桿菌的酶活性檢測發現，LeSAT1的酰基化活性特異于紫草素，而LeAAT1的酰基化活性特異于左旋紫草素。兩種酶均能識別乙酰輔酶A（acetyl-CoA）、異丁酰輔酶A（isobutyryl-CoA）和異戊酰輔酶A（isovaleryl-CoA）作為酰基供體，生成對應的紫草素/左旋紫草素衍生物，其中兩種酶對乙酰輔酶A表現出最高活性。這些發現與完整紫草植株和細胞培養中的紫草素/左旋紫草素衍生物組成一致。編碼這兩種酶的基因在黑暗中、以生產色素的M9培養基培養的根和細胞中表現出優先表達。這些結果表明，LeSAT1和LeAAT1是對映體特異性的酰基轉移酶，可生成多種紫草素/左旋紫草素衍生物。

紫草素和左旋紫草素是一對紅色萘醌類衍生物的對映體，是紫草科植物特有的次生代謝產物。這些衍生物具有多種生物活性，包括促進傷口愈合、抗菌、抗腺病毒和抗癌作用，因此生產這些衍生物的植物（如歐洲的紫草Alkanna tinctoria，東亞的紫草Lithospermum erythrorhizon和新疆紫草Arnebia euchroma）已被用作傳統藥材數百年。不同植物種類中紫草素/左旋紫草素衍生物的組成存在顯著差異。例如，完整的紫草植株主要生成乙酰紫草素和β-羥異戊酰紫草素，而紫草A. tinctoria和新疆紫草A. euchroma主要生成β,β-二甲基丙烯基左旋紫草素，另一種中國紫草植物Onosma confertum則主要合成β,β-二甲基丙烯基紫草素和乙酰紫草素。此外，還分離出了許多含有不同支鏈酰基的衍生物。雖然不同植物來源的紫草素/左旋紫草素衍生物的生物活性已被報道有所差異，但其生物活性與酰基化形式及其分子構型之間的關系仍不明確。

在過去幾十年中，已經建立了能夠大量生產紫草素/左旋紫草素衍生物的紫草科植物細胞培養方法。這些細胞培養系統已被用于研究紫草素/左旋紫草素的生物合成途徑。目前為止，已鑒定和表征了兩個專門參與紫草素/左旋紫草素生物合成途徑的酶。紫草中的對羥基苯甲酸香葉基轉移酶（p-Hydroxybenzoic acid geranyltransferase）催化對羥基苯甲酸和香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate）偶聯生成間-香葉基-對羥基苯甲酸（m-geranyl-p-hydroxybenzoic acid），這是形成紫草素/左旋紫草素基本碳骨架的第一步。新疆紫草中的一種最近被報道的細胞色素P450酶（CYP76B74）催化香葉基氫醌（geranylhydroquinone, GHQ）在3″位的羥化反應，生成3″-羥基香葉基氫醌（GHQ-3′'-OH）。然而，在此步驟之后，催化環化反應形成萘醌結構的酶以及催化紫草素和左旋紫草素酰基化生成其多種衍生物的酶仍知之甚少。

紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成途徑 虛線箭頭表示尚未鑒定相關酶的反應步驟。本研究中鑒定了LeSAT1和LeAAT1。LePGT為紫草（L. erythrorhizon）中的對羥基苯甲酸香葉基轉移酶。

為了鑒定和表征參與紫草素/左旋紫草素生物合成的特定基因和蛋白質，我們此前通過培養的紫草細胞進行了比較蛋白質組學分析，并鑒定了多個候選基因，包括酰基轉移酶（Takanashi等，2019）。這些酰基轉移酶屬于BAHD酰基轉移酶家族，該家族從各種酰基活化輔酶A硫酯供體中將酰基轉移至受體分子（主要是酚類化合物），從而促進植物次生代謝產物的多樣性（D’Auria，2006；Bontpart等，2015；Kusano等，2019）。

本研究報道了兩種BAHD酰基轉移酶的鑒定和表征，分別是紫草素O-酰基轉移酶（LeSAT1）和左旋紫草素O-酰基轉移酶（LeAAT1）。這兩種酶分別催化紫草素或左旋紫草素的對映體特異性酰基化反應（圖1）。底物特異性分析表明，兩種酶均可將酰基從乙酰輔酶A（acetyl-CoA）、異丁酰輔酶A（isobutyryl-CoA）和異戊酰輔酶A（isovaleryl-CoA）轉移到受體分子。我們的研究表明，LeSAT1和LeAAT1是生成多樣化紫草素/左旋紫草素衍生物的關鍵酶。

結果

培養的紫草細胞中紫草素/左旋紫草素衍生物的手性組成及酰基化活性

紫草科（Boraginaceae）植物能夠生成多種紫草素/左旋紫草素衍生物，其組成在不同植物種類之間、甚至同種植物的不同個體之間都有所差異。為了確定培養在M9培養基中的紫草細胞中紫草素/左旋紫草素衍生物的組成，研究采用了帶手性柱的高效液相色譜（HPLC）分析。結果表明，最主要的化合物為乙酰紫草素（44.6%）和β-羥異戊酰紫草素（26.8%；見表1），其次是它們的對映體乙酰左旋紫草素（15.3%）和β-羥異戊酰左旋紫草素（5.7%）。還檢測到其他紫草素衍生物，如異丁酰紫草素（3.7%）和異戊酰紫草素（0.8%）。這些結果表明，培養的紫草細胞主要生成紫草素而非左旋紫草素衍生物，這一結果與從完整的紫草植株和愈傷組織培養中獲得的結果一致（Fukui等，1983；Zhou等，2011）。

Data are means ± sd of three independently prepared cultured cells.

Compounds	Structures of Acyl Groups	Proportion
		%
Acetylshikonin	OCOCH3	44.6 ± 2.7
β-Hydroxyisovalerylshikonin	OCOCH2C(CH3)2OH	26.8 ± 2.2
Acetylalkannin	OCOCH3	15.3 ± 0.4
β-Hydroxyisovalerylalkannin	OCOCH2C(CH3)2OH	5.7 ± 0.3
Isobutyrylshikonin	OCOCH(CH3)2	3.7 ± 0.5
Isovalerylshikonin	OCOCH2CH(CH3)2	0.8 ± 0.1

為了表征培養的紫草（L. erythrorhizon）細胞無細胞提取物中的紫草素酰基化活性，進行了酶活性檢測實驗，將提取物與紫草素或左旋紫草素以及酰基供體乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育（圖2A）。結果顯示，這些提取物對紫草素和左旋紫草素的乙酰化程度相當（圖2B）。此外，培養的紫草細胞提取物還利用異丁酰輔酶A（isobutyryl-CoA）和異戊酰輔酶A（isovaleryl-CoA）作為酰基供體對紫草素和左旋紫草素進行酰基化（補充圖S1）。這些結果表明，培養的紫草細胞至少含有一種具有廣泛底物特異性的酰基轉移酶，能夠利用多種酰基供體，并以紫草素和左旋紫草素作為酰基受體。

通過手性HPLC分析培養的紫草（*L. erythrorhizon*）細胞脫鹽無細胞提取物中的紫草素和左旋紫草素乙酰化活性 A、乙酰化反應示意圖；B、乙酰化產物的HPLC色譜圖。標注的化合物：1，紫草素；2，左旋紫草素；3，乙酰左旋紫草素；4，乙酰紫草素。

酰基轉移酶基因的鑒定

我們之前對紫草的轉錄組和蛋白質組進行了比較分析，鑒定出四個在紫草素生產的培養細胞中表達的酰基轉移酶候選基因（Takanashi等，2019）。其中三個候選基因（comp39163_c0_seq2、comp63127_c0_seq2和comp89737_c13_seq3）的表達在細胞培養于M9培養基并置于黑暗條件下時特異性誘導，此條件下可生成高水平的紫草素/左旋紫草素衍生物。而第四個候選基因（comp92813_c0_seq1）在M9培養基中培養的細胞中被檢測到，無論是否有光照，此條件下紫草素/左旋紫草素的生產會被強烈抑制（補充圖S2）。這四個候選基因屬于BAHD酰基轉移酶家族，該家族的酶能將酰基從多種酰基活化輔酶A硫酯供體轉移至受體分子（D’Auria，2006）。 在這四個基因中，兩個基因（comp63127_c0_seq2和comp92813_c0_seq1）具有超過1200bp的開放閱讀框（ORF），這是BAHD酰基轉移酶基因的平均長度，同時包含了III類BAHD酰基轉移酶的五個保守基序（補充圖S3；St-Pierre和De Luca，2000；Tuominen等，2011）。另外兩個基因（comp39163_c0_seq2和comp89737_c13_seq3）分別缺失一個和兩個保守基序。因此，對前兩個基因（comp63127_c0_seq2和comp92813_c0_seq1）進行了克隆和進一步分析。

使用大腸桿菌的兩種BAHD酰基轉移酶的體外分析

通過異源表達系統在大腸桿菌中評估了這兩個候選BAHD酶的酶活性。兩個基因的編碼序列經過優化以適應大腸桿菌的表達。由于comp63127_c0_seq2基因編碼的重組蛋白在沒有分子伴侶的情況下不可溶，因此共同表達了分子伴侶蛋白GroEL和GroES。在后續的鎳親和層析純化中，由于comp63127_c0_seq2編碼的重組蛋白與GroEL之間的強相互作用，兩者一起被洗脫（補充圖S4）。相比之下，comp92813_c0_seq1編碼的蛋白表達不依賴于GroEL（補充圖S4）。 使用乙酰輔酶A作為酰基供體，紫草素或左旋紫草素作為酰基受體，對這些蛋白的酶活性進行了評估。HPLC分析表明，comp63127_c0_seq2基因編碼的酰基轉移酶識別紫草素但不識別左旋紫草素作為受體底物，并生成乙酰紫草素作為唯一產物（圖3）。相反，comp92813_c0_seq1基因編碼的BAHD酰基轉移酶識別左旋紫草素而不識別紫草素作為受體底物（圖3）。這些結果表明，這兩種BAHD酰基轉移酶（分別命名為LeSAT1和LeAAT1）在紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成中具有不同的功能。

LeSAT1和LeAAT1對紫草素和左旋紫草素的立體特異性乙酰化反應（通過手性HPLC分析） LeSAT1催化紫草素的乙酰化，而LeAAT1催化左旋紫草素的乙酰化。標注的化合物：1，紫草素；2，左旋紫草素；3，乙酰左旋紫草素；4，乙酰紫草素。

為了研究LeSAT1和LeAAT1的底物特異性，分別將這兩種酶與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）和紫草素/左旋紫草素生物合成途徑中的三個中間體（GHQ、GHQ-3″-OH和去氧紫草素）共同孵育（圖1）。結果顯示，這兩種酶均未催化這些中間體的乙酰化反應。此外，還對LeSAT1和LeAAT1的酰基供體特異性進行了分析。LeSAT1能夠以異丁酰輔酶A（isobutyryl-CoA）和異戊酰輔酶A（isovaleryl-CoA）作為酰基供體催化紫草素的酰基化，分別生成異丁酰紫草素和異戊酰紫草素，但無法以丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）作為酰基供體（圖4）。當使用異丁酰輔酶A和異戊酰輔酶A作為酰基供體時，LeSAT1的酶活性分別約為使用乙酰輔酶A時的三分之二和二分之一。對LeAAT1進行類似的分析發現，其使用左旋紫草素作為酰基受體的特異性表現與LeSAT1一致（圖4）。這些結果與培養細胞中檢測到的天然酶活性一致（補充圖S1），并與紫草植物中最豐富的乙酰化紫草素/左旋紫草素衍生物的組成分布（表1）相吻合。

LeSAT1和LeAAT1的底物特異性分析 以紫草素和左旋紫草素分別作為酰基受體，兩種酶的酰基化活性與供體酰基鏈的大小呈反比關系。N.D.表示未檢測到活性。數據為三次技術重復的平均值±標準差（SD）。

這些底物特異性通過動力學分析進一步驗證。LeSAT1和LeAAT1對其受體底物的表觀親和力（Km值）分別為159 μM和54 μM。當使用較短的酰基輔酶A（acyl-CoA）作為酰基供體時，兩種酶的催化速率常數（kcat）均較高（表2）。LeAAT1對左旋紫草素的催化效率（kcat/Km）為12.7 mM?1 s?1，與III類BAHD酰基轉移酶的報告值相似，例如，花紅鼠尾草（Salvia splendens）中Ss5MaT2在合成單去丙二酸鼠尾草素（monodemalonylsalvianin）時的催化效率為13.5 mM?1 s?1（Suzuki等，2004），以及古柯樹（Erythroxylum coca）中EcCS在合成甲基古柯堿（methylecgonine）時的催化效率為26.0 mM?1 s?1（Schmidt等，2015）。有趣的是，LeSAT1的催化效率僅為LeAAT1的約10%，這可能是由于在LeSAT1的酶制備中受分子伴侶蛋白的污染所致。這種污染導致表觀蛋白濃度升高，同時由于存在非相關蛋白，使得酶活性的kcat值降低（補充圖S4）。

對pH依賴性的研究表明，LeSAT1和LeAAT1的乙酰化活性在pH 5.0時達到最大，這是一個適度的酸性條件（圖5）。

Data are means ± sd of three independently prepared samples with three technical replicates for each sample. Shikonin and alkannin were incubated with 0.25 mm of acetyl-CoA, and acyl-CoAs were incubated with 0.5 mm of shikonin or alkannin.

Enzyme	Substrate	Product	K**m	kcat	kcat/K**m
			μ**m	s**?1	mm?1 s**?1
LeSAT1	Shikonin	Acetylshikonin	159 ± 25	0.185 ± 0.031	1.23 ± 0.32
Acetyl-CoA	Acetylshikonin	53 ± 4	0.093 ± 0.017	1.77 ± 0.27
Isobutyryl-CoA	Isobutyrylshikonin	78 ± 18	0.083 ± 0.018	1.07 ± 0.11
Isovaleryl-CoA	Isovalerylshikonin	39 ± 5	0.048 ± 0.007	1.24 ± 0.13
LeAAT1	Alkannin	Acetylalkannin	54 ± 13	0.68 ± 0.27	12.7 ± 4.4
Acetyl-CoA	Acetylalkannin	92 ± 39	0.94 ± 0.30	11.9 ± 3.6
Isobutyryl-CoA	Isobutyrylalkannin	116 ± 60	0.78 ± 0.30	7.87 ± 2.5
Isovaleryl-CoA	Isovalerylalkannin	20 ± 7	0.14 ± 0.04	9.72 ± 4.1

乙酰化活性的pH依賴性 評估了LeSAT1（A）和LeAAT1（B）的酰基化活性。兩種酶的乙酰化活性在pH 5.0時達到最大。數據為三次技術重復的平均值 ± 標準差（SD）。

LeSAT1和LeAAT1的器官特異性表達

通過提取完整紫草（L. erythrorhizon）植株的根、莖和葉，以及在三種不同生長條件下培養的細胞的總RNA，研究了LeSAT1和LeAAT1在完整植株和培養細胞中的表達譜。反轉錄定量PCR（RT-qPCR）分析表明，這兩個基因在完整植株的根部和黑暗條件下M9培養基中培養的細胞中優先表達，在這些條件下紫草素/左旋紫草素衍生物的合成和積累達到最高水平（圖6；Wu等，2017；Takanashi等，2019）。

為了評估各器官中的紫草素/左旋紫草素乙酰化活性，將根、莖和葉的無細胞提取物與紫草素或左旋紫草素在酰基供體乙酰輔酶A的存在下共同孵育。結果顯示，乙酰化活性僅在根中檢測到（補充圖S5），這一結果與RT-qPCR分析一致（圖6）。

LeSAT1和LeAAT1的器官特異性表達 通過RT-qPCR分析了LeSAT1和LeAAT1在三種不同組織和三種細胞培養條件下的表達情況，以GAPDH基因表達作為內參。結果表明，LeSAT1和LeAAT1特異性表達于紫草素/左旋紫草素衍生物高水平積累的組織和細胞中。數據為兩組獨立制備樣品的三次技術重復的平均值 ± 標準差（SD）。

討論

本研究鑒定了兩種BAHD酰基轉移酶，LeSAT1和LeAAT1，作為催化紫草（L. erythrorhizon）中紫草素/左旋紫草素生物合成途徑最后一步的酶。LeSAT1將紫草素轉化為乙酰紫草素，這是這些細胞中最豐富的紫草素衍生物；而LeAAT1參與乙酰左旋紫草素的生物合成，這是紫草中最豐富的左旋紫草素衍生物。

盡管培養的紫草細胞中紫草素和左旋紫草素衍生物的比例為8:2，但粗酶活性檢測表明，紫草細胞幾乎以相等的量生成紫草素和左旋紫草素衍生物。這些結果表明，紫草素和左旋紫草素衍生物的比例不是由紫草素或左旋紫草素的立體特異性酰基化決定的，而是由去氧紫草素的立體特異性羥基化決定的，這可能涉及兩個獨立的立體選擇性羥化酶。

粗酶活性檢測顯示，酰基化活性與酰基輔酶A（acyl-CoA）的鏈長呈反比關系。這些結果與LeSAT1和LeAAT1的底物特異性相似，但相對使用異戊酰輔酶A的活性不同，表明可能有其他BAHD酰基轉移酶參與紫草素/左旋紫草素衍生物的生物合成。RT-qPCR分析也支持這一觀點，顯示在黑暗條件下M9培養基中培養的細胞中，LeSAT1的相對表達量至少是LeAAT1的10倍。此外，粗酶活性檢測顯示紫草素和左旋紫草素的酰基化水平相似。不幸的是，由于LeSAT1在純化過程中需要與分子伴侶蛋白GroEL共純化，未能比較LeSAT1和LeAAT1的動力學參數。所有嘗試去除GroEL的努力均未成功，包括在結合緩沖液中加入ATP以及在鎳柱層析后使用離子交換樹脂進行分離（補充圖S4）。

紫草素/左旋紫草素衍生物在紫草細胞內合成，并積累于胞間隙中。電子顯微鏡和抑制劑處理的研究表明，這一分泌過程可能由囊泡介導的轉運系統完成（Tsukada和Tabata，1984；Tatsumi等，2016）。使用14C標記的去氧紫草素和紫草素的研究表明，一個羥化酶和一個乙酰轉移酶可以直接將去氧紫草素轉化為乙酰紫草素，并與囊泡膜的定位協同進行（Okamoto等，1995）。由于BAHD酰基轉移酶沒有運輸肽段或跨膜結構域，因此這些可溶性蛋白可能定位于細胞質中（D’Auria，2006）。在紫草細胞中，LeSAT1和LeAAT1可能與膜結合的羥化酶相互作用，形成一個稱為代謝體（metabolon）的多酶復合體，可以直接將去氧紫草素轉化為酰基化的紫草素/左旋紫草素衍生物。這類似于其他次生代謝產物生物合成途徑，其中可溶性酶通過膜結合的細胞色素P450錨定（Mucha等，2019；Nakayama等，2019）。

培養的紫草細胞主要生成乙酰紫草素和β-羥異戊酰紫草素，同時還生物合成異丁酰紫草素和異戊酰紫草素。底物特異性分析顯示，LeSAT1和LeAAT1在以乙酰輔酶A為酰基供體時活性最高，但也能接受異丁酰輔酶A和異戊酰輔酶A。這些發現表明，紫草中紫草素/左旋紫草素衍生物的多樣性可能由LeSAT1和LeAAT1的底物特異性決定。紫草科植物的紫草素/左旋紫草素衍生物組成因植物種類而異（Fukui等，1983；Assimopoulou等，2006；Zhou等，2011）。研究LeSAT1和LeAAT1直系同源基因的底物特異性是否與其他紫草科植物中的紫草素/左旋紫草素衍生物組成相關將是一個有趣的方向。對新疆紫草（A. euchroma）和牛舌草（Echium plantagineum）等紫草科植物的最新組學研究可能有助于鑒定LeSAT1和LeAAT1的同源基因（Wang等，2014；Wu等，2017；Tang等，2020）。

LeSAT1和LeAAT1的氨基酸序列一致性為64%，且與參與番茄（Solanum lycopersicum）中酰基糖合成的BAHD酶（如SlASAT1、SlASAT2和SlASAT3）的氨基酸一致性為32%至36%（Schilmiller等，2015；Fan等，2016）。番茄中的酰基糖由四種BAHD酰基轉移酶的連續酰基化反應合成。這些酶的酶活性在糖核心的酰基化位點和酰基供體的偏好上存在差異（Fan等，2016）。與栽培番茄中的同源基因相比，野生番茄物種（如Solanum pennellii、Solanum pimpinellifolium、Solanum galapagense等）中的這些同源基因在酰基化順序和底物特異性上存在差異（Fan等，2017；Moghe等，2017；Nadakuduti等，2017），導致茄科植物中酰基糖結構的多樣性（Fan等，2019）。對野生番茄及其相關物種的研究表明，參與酰基糖生物合成的BAHD酶起源于50至80百萬年前的生物堿生物合成基因，并隨后進化（Moghe等，2017）。對紫草科植物BAHD酰基轉移酶的類似功能分析可能揭示其家族成員的起源及其負責紫草素/左旋紫草素衍生物多樣性的分子進化過程。

夾竹桃科植物長春花（Catharanthus roseus）中的BAHD酰基轉移酶也與LeSAT1和LeAAT1具有31%至38%的氨基酸一致性。長春花中參與單萜吲哚生物堿生物合成的兩種BAHD酰基轉移酶，CrMAT（Laflamme等，2001）和CrTAT（Carqueijeiro等，2018），被重新鑒定為對映體特異性酶（Williams等，2019），分別作用于(+)-vincadifformine和(-)-tabersonine的側鏈羥基。分離的對映體特異性細胞色素P450也參與了CrMAT和CrTAT各自底物的生成（Williams等，2019）。這表明可能有單獨的羥化酶作用于去氧紫草素，分別生成用于LeSAT1和LeAAT1反應的紫草素和左旋紫草素底物。

材料與方法

植物材料和化學試劑

紫草（Lithospermum erythrorhizon）植物在培養室中以23°C、16小時光照/8小時黑暗的光周期條件下生長約4個月。采集葉片、莖和主根，并儲存于?80°C。紫草細胞培養按照Takanashi等（2019）的描述進行維護。GHQ按照Baeza等（2012）的方法合成，GHQ-3″-OH通過均一苯酸內酯合成，詳細步驟見補充協議S1。紫草素、左旋紫草素及其衍生物從Nagara Science公司購買。乙酰輔酶A（acetyl-CoA）購自富士膠片和光化學（Fujifilm Wako），異丁酰輔酶A（isobutyryl-CoA）、異戊酰輔酶A（isovaleryl-CoA）和丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）購自Sigma-Aldrich。

培養基中紫草素/左旋紫草素衍生物的檢測

在改良的Murashige和Skoog培養基上生長的培養細胞被轉移至M9培養基中以誘導紫草素/左旋紫草素的生產。在23°C、黑暗條件下于旋轉搖床（80 rpm）上孵育2周后，從3 mL M9培養基中用等體積的乙酸乙酯提取紫草素/左旋紫草素衍生物。提取液經蒸發干燥后，用100 μL甲醇溶解，并以14,400g離心5分鐘。取上清液，用Shimadzu公司的SPD-M20A系統（配備CHIRALPAK IH-3柱，內徑4.6 mm×長度250 mm；Daicel）進行HPLC分析。分離條件為35°C、流速1.0 mL min?1，采用60%（v/v）乙腈含0.4%（v/v）甲酸的等度洗脫。

粗酶提取物的制備（從培養細胞和完整植株中提取）

紫草細胞在M9培養基中培養2周，隨后將液體石蠟覆蓋在培養基上3天以去除紫草素/左旋紫草素衍生物。通過抽濾收集產色素的細胞，并儲存于?80°C。為了制備無細胞提取物，將細胞和完整植株的各器官在含有以下成分的緩沖液中勻漿：2.5 mM乙酸、50 mM醋酸鈉、100 mM氯化鈉、10 mM二硫蘇糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.5%（w/v）抗壞血酸鈉、1%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），pH 6.0。在10,000g下于4°C離心30分鐘，將上清液通過棉漏斗過濾，再次離心，并用PD-10柱（GE Healthcare）脫鹽。

LeSAT1和LeAAT1在大腸桿菌中的異源表達

LeSAT1和LeAAT1的全長開放閱讀框（ORF）經過優化以適合在大腸桿菌中表達。將全長LeSAT1和LeAAT1用NdeI和SalI酶切后，克隆至pCold I載體（Takara Bio）的NdeI/SalI位點。這些構建體用于轉化大腸桿菌Origami菌株。為了表達LeSAT1，使用共表達分子伴侶GroEL和GroES的pGro7質粒（Takara Bio）進行共轉化。轉化子在300 mL裂解原培養基（lysogeny broth medium）中以37°C培養。當OD600達到0.6至0.8時，通過在冰上冷休克30分鐘并添加1 mM異丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導蛋白表達，隨后在15°C下進一步培養12至24小時。

蛋白提取與純化（從大腸桿菌中表達的LeSAT1和LeAAT1）

以下所有步驟均在約4°C下進行。收獲的細胞在裂解緩沖液中進行超聲破碎，裂解緩沖液包含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、5%（v/v）甘油、20 mM MgCl?和1%（v/v）TWEEN 20。細胞碎片通過10,000g離心20分鐘去除。將上清液加載到含有2 mL鎳樹脂（Ni Sepharose 6 Fast Flow；GE Healthcare）的親和柱上。對于LeSAT1的純化，使用含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、10%（v/v）甘油、500 mM NaCl和20 mM咪唑的結合緩沖液清洗兩次4 mL。對于LeAAT1，將咪唑濃度調整為50 mM。帶有His標簽的LeSAT1或LeAAT1通過含50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、10%（v/v）甘油、500 mM NaCl和500 mM咪唑的洗脫緩沖液進行四次2 mL的洗脫。對于LeSAT1的純化，在結合緩沖液中補充10 mM ATP，并將柱子在室溫下孵育1小時后進行洗脫。純化的酶組分通過含50 mM MES（pH 6.5）的PD-10柱脫鹽，用于后續的酶活性檢測。

酶活性檢測

酶活性檢測在含50 mM MES（pH 5.5，50 μL）的反應體系中進行，反應體系中包含10 mM抗壞血酸鈉、0.3%（v/v）Triton-X、酶組分（25 μL）和底物（250 μM酰基供體和500 μM酰基受體）。在30°C孵育5分鐘后，用50 μL乙酸乙酯提取反應產物，并以14,400g離心5分鐘。取上清液并使用CHIRALPAK IH-3柱（Daicel）的HPLC進行分析（如前所述）。乙酰化活性的最佳pH值通過包含3,3′-二甲基戊二酸、Tris和2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇的緩沖液進行確定。紫草素和左旋紫草素（每種2.5–250 μM）以及酰基輔酶A（2.5–500 μM）的動力學參數通過分別使用250 μM乙酰輔酶A和500 μM紫草素或左旋紫草素測定。

RNA提取與RT-qPCR分析

使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）或ISOSPIN Plant RNA（Nippon Gene）從培養細胞和完整植株中提取總RNA。經DNase I處理后，將總RNA使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Toyobo）逆轉錄。RT-qPCR通過KOD SYBR qPCR Mix（Toyobo）和基因特異性引物（補充表S1）在StepOnePlus實時PCR系統（Thermo Fisher Scientific）上進行。每個樣本的基因表達水平相對于內參基因GAPDH mRNA進行標準化，使用2?ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen，2001）結合標準曲線法計算（Larionov等，2005）。

登錄號

本文涉及的序列數據可從日本DNA數據庫（DDBJ）獲取，登錄號為LC520137（LeSAT1）和LC520138（LeAAT1）。