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肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期復發仍然是一個具有挑戰性的領域，其中涉及的機制尚未完全被理解。盡管微血管侵犯（Microvascular invasion，MVI）與HCC早期復發相關，但缺乏用于診斷和預后評估的理想生物標志物。DNA甲基化和長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為表觀遺傳調控因子，在HCC中的表達變化與疾病發病機制密切相關。因此，鑒定可以預測肝癌患者預后的DNA甲基化位點，并闡明驅動HCC侵襲性的分子機制至關重要。

近日，《Experimental & Molecular Medicine》期刊發表了題為“VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma“的研究論文，該研究探討了在肝細胞癌（HCC）中，通過CpG甲基化調控的非編碼RNA VIM-AS1（vimentin antisense RNA1）（一種1.8 kb長的非編碼RNA）與IGF2BP1合作，通過EPHA3降解來抑制腫瘤侵襲性。研究發現，VIM-AS1高甲基化與HCC預后不良相關，并能夠通過影響EPHA3 mRNA穩定性來調控HCC侵襲性。

標題：VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma（VIM-AS1 受 CpG 甲基化調控，與 IGF2BP1 協同作用，通過降解 EPHA3 抑制肝細胞癌中的腫瘤侵襲性）

期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）

影響因子：IF 9.5

技術平臺：BS、ChIP-seq、MeRIP-seq分析、RNA-seq等（易基因金牌技術）

本研究首先利用CGRC和TCGA數據庫中HCC患者樣本的DNA甲基化數據，鑒定出HCC中的高甲基化CpG位點。數據分析結果揭示了cg02746869是VIM-AS1的關鍵調控位點。調控VIM-AS1表達的HCC細胞RNA-seq測序揭示了EPHA3是VIM-AS1的病理靶標，在HCC中發揮致癌作用。高甲基化導致的VIM-AS1表達抑制顯著影響HCC細胞動態變化，尤其損害細胞的移動性和侵襲性。從機制上講，VIM-AS1表達降低通過增強IGF2BP1與EPHA3 mRNA的結合來穩定EPHA3 mRNA，導致EPHA3 mRNA表達增加，并促進HCC進展。進一步體內實驗證實，VIM-AS1-EPHA3軸調控HCC的腫瘤生長和腫瘤微環境。以上研究結果表明，cg02746869位點高甲基化導致的VIM-AS1下調通過m6A依賴性機制增加EPHA3 mRNA表達，從而增加HCC侵襲性。

結果圖形

（1）cg02746869 甲基化狀態調控?VIM-AS1?在 HCC 中的表達

圖1：DNA甲基化分析揭示HCC患者VIM-AS1中cg02746869位點的高甲基化狀態。

1. 根據CGRC和TCGA數據庫的甲基化組數據，示意圖顯示在HCC中鑒定出的50個高甲基化位點（左圖）；50個高甲基化位點位于CpG islands、CpG shores、CpG shelves和open sea區域（中間圖）；50個高甲基化位點與轉錄起始位點（TSS）之間的距離分布（右圖）。
2. 在多種惡性腫瘤中cg02746869位點的beta值分析。
3. 熱圖表示不同類型癌癥中VIM-AS1表達和cg02746869甲基化模式（左圖）。cg02746869位點的beta值與VIM-AS1表達水平的相關性分析（右圖）。
4. 在THLE2和HUH1中cg02746869位點的甲基化和相關VIM-AS1表達。
5. 在DNMT3A實驗組中使用HRM和BS-seq驗證甲基化水平增加，并檢測到VIM-AS1表達下調。在TET1實驗組中使用HRM和BS-seq驗證甲基化水平下降，并驗證了VIM-AS1表達。
6. H3K27ac and H3K4me3的ChIP-seq基因組瀏覽器顯示THLE2和HUH1中cg02746869位點活性標記富集結果。
7. 甲基化和去甲基化后cg02746869位點的ChIP-qPCR用于評估組蛋白活性和轉錄因子（TF）結合。Con =對照組，DNMT3A = 高甲基化cg02746869位點，TET1 = 低甲基化cg02746869位點。

（2）VIM-AS1過表達抑制癌細胞侵襲性

圖2：VIM-AS1水平整體升高進而下調與細胞粘附相關的基因。

1. 使用FISH檢測VIM-AS1定位的代表性圖像（左圖）。VIM-AS1相對強度，表示亞細胞定位的百分比（中間圖）。THLE2和HUH1之間每種亞細胞定位強度比較（右圖）。
2. 通過qRT-PCR（左圖）和RNA-seq（右圖）驗證VIM-AS1過表達細胞。
3. 在VIM-AS1過表達后上調和下調基因的差異表達基因（DEG）相關性分析圖（左圖）。紅色=前5個上調基因；藍色=前5個下調基因。VIM-AS1下調的DEG的GO分析（右圖）。
4. 與細胞粘附相關下調DEG的GSEA結果。
5. VIM-AS1過表達細胞中細胞粘附相關基因qRT-PCR。
6. 遷移和侵襲實驗的代表性圖像和定量分析。

（3）VIM-AS1?調控EPHA3?mRNA穩定性

圖3：VIM-AS1調節EPHA3 mRNA穩定性，與HCC預后不良相關。

1. THLE2、HUH1以及甲基化修飾樣本中EPHA3 mRNA相對表達量。顯示EPHA3 mRNA表達量對VIM-AS1調控的響應變化。VIM-AS1 OE = VIM-AS1過表達，VIM-AS1 KD = VIM-AS1敲低。
2. 使用放線菌素D處理HUH1細胞后EPHA3 mRNA的RNA穩定性實驗。
3. VIM-AS1過表達后EPHA3蛋白的免疫印跡圖。
4. EPHA3 mRNA敲低后的細胞遷移和侵襲實驗。
5. 使用GEPIA分析了不同階段VIM-AS1和EPHA3 RNA的表達量。
6. Kaplan-Meier生存曲線分析所有HCC患者以及微血管侵犯（MVI）患者EPHA3 mRNA預后生存率。

（4）EPHA3?mRNA 穩定性通過 IGF2BP1 與 m6A 位點結合來確定

圖4：IGF2BP1以m6A依賴性方式破壞EPHA3 mRNA穩定性。

1. 基因組瀏覽器快照顯示GSE928399中HEK293T細胞EPHA3 MeRIP-seq的m6A修飾位點（頂部），使用RM2Target預測m6A位點（中間）以及實驗靶向的3′UTR m6A位點區域（底部）。EPHA3的3′ UTR的MeRIP-qPCR結果。
2. HCC腫瘤組織（T）相對于正常組織（N）中m6A修飾因子的差異表達；FC=倍數變化。
3. RIP-qPCR實驗顯示HUH1細胞中與IGF2BP1結合的EPHA3和VIM-AS1 RNA。
4. IGF2BP1沉默對EPHA3 mRNA表達的影響。
5. 對包括m6A位點在內的EPHA3 3′UTR野生型（WT）和突變型（MUT）構建體的MeRIP-qPCR分析。
6. 在IGF2BP1沉默后使用WT和MUT構建體進行的熒光素酶實驗。

（5）VIM-AS1?干擾 IGF2BP1 與?EPHA3?結合

圖5：VIM-AS1通過抑制IGF2BP1與EPHA3 mRNA的互作來調節EPHA3 mRNA表達。

a-b. RIP-qPCR實驗顯示，在HUH1細胞中VIM-AS1過表達（a）和在THLE2細胞中VIM-AS1敲低（b）后，VIM-AS1和EPHA3 mRNA對IGF2BP1的結合親和力。

c. 示意圖顯示VIM-AS1表達增加/減少對EPHA3 mRNA的影響如何通過IGF2BP1介導。

d. FISH結果顯示VIM-AS1和IGF2BP1（左圖）以及EPHA3 mRNA和IGF2BP1（右圖）定位。條形圖顯示每個FISH數據集相對共定位熒光強度。白色箭頭=VIM-AS1或EPHA3 mRNA與IGF2BP1共定位區域。

（6）EPHA3 mRNA在與肝細胞癌（HCC）相關的成纖維細胞中富集。

圖6：VIM-AS1-EPHA3軸調控基因參與HCC侵襲性。

1. 在VIM-AS1過表達細胞和VIM-AS1與EPHA3共過表達細胞中VIM-AS1和EPHA3的相對表達量。
2. GSEA顯示與細胞粘附相關的基因。紅色條形=因VIM-AS1過表達而表達量減少、但在VIM-AS1和EPHA3都過表達時增加的DEGs。
3. 基因網絡分析揭示，由VIM-AS1調節的EPHA3 mRNA與EPHA3 mRNA表達量一同下調/上調。
4. 與EPHA3 mRNA協同調控基因的單細胞RNA-seq圖譜（GSE149614）。

（7）VIM-AS1?過表達抑制?EPHA3?mRNA 并減少體內腫瘤發生

圖7：VIM-AS1抑制肝細胞癌中腫瘤微環境的變化。

1. 每組腫瘤體積和重量變化圖表。
2. 從每組切除的腫瘤圖像。
3. 細胞和結構變化的HE染色切片。
4. 膠原沉積的天狼星紅染色。
5. 馬松三色染色及膠原沉積面積的定量。
6. α-SMA（頂部）和CD31（底部）的IF染色及定量。白色箭頭= CD31陽性血管。Con=對照組，VIM-AS1 = VIM-AS1過表達，VIM-AS1/EPHA3 = VIM-AS1和EPHA3共過表達。

易小結

本研究通過BS-seq和ChIP-seq及對應的RNA-seq分析揭示了cg02746869是VIM-AS1的關鍵調控位點，其高甲基化與VIM-AS1的表達下調相關。VIM-AS1下調通過增強IGF2BP1與EPHA3 mRNA結合，增加EPHA3 mRNA表達，從而促進HCC進展。在HCC細胞中，VIM-AS1過表達能夠降低與細胞粘附相關基因表達，并抑制HCC細胞的遷移和侵襲能力。在動物模型中，VIM-AS1過表達抑制了腫瘤生長和腫瘤微環境變化。

研究結果表明，VIM-AS1表達受CpG甲基化調控，其下調通過m6A依賴性機制增加了EPHA3 mRNA表達，從而增加HCC侵襲性。VIM-AS1和EPHA3可能作為HCC診斷和治療的表觀遺傳標記。

本研究揭示了VIM-AS1通過表觀遺傳機制調控HCC侵襲性的新途徑。確定了VIM-AS1和EPHA3在HCC進展中的重要作用，為HCC的治療提供了新的靶點。并提供了基于表觀遺傳學的標志物，可能改善HCC的早期檢測和預后評估。

易基因：DNA甲基化研究基本思路

DNA甲基化一般遵循四個步驟：

首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。

其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。

再次，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。

最后，對篩選出的目標區域DNA甲基化進行驗證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測序（Target-BS）。

關于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術支持，能廣泛應用在個體發育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測序技術通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉變為尿嘧啶U，進而通過接頭序列介導的 PCR 技術將尿嘧啶U轉變為胸腺嘧啶T。

應用方向：

WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關鍵位點）

• 全基因組甲基化圖譜課題
• 標志物篩選課題
• 小規模研究課題

技術優勢：

• 應用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
• 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態。

技術類型	起始量	特點	覆蓋度
常規WGBS	1μg gDNA	正常BS建庫技術	95%
Micro DNA-WGBS	1-10000個細胞/1ng基因組DNA	在常規WGBS技術上進行技術改進，使得起始量大大降低，適合珍稀樣本的研究	95%
scWGBS	單細胞/1-10個細胞	克服了組織內部細胞異質性的影響，可以滿足單個細胞層面的課題研究	20%
Micro DNA-XRBS	1ng gDNA、單細胞	為Micro DNA-WGBS的簡化版本，特別適用于大樣本量的珍稀樣本DNA甲基化研究	20M CG

關于易基因染色質免疫共沉淀測序?(ChIP-seq)

染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內蛋白質與DNA相互作用的經典方法。將ChIP與高通量測序技術相結合的ChIP-Seq技術，可在全基因組范圍對特定蛋白的DNA結合位點進行高效而準確的篩選與鑒定，為研究的深入開展打下基礎。

DNA與蛋白質的相互作用與基因的轉錄、染色質的空間構型和構象密切相關。運用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結合蛋白或轉錄因子特異性抗體富集與其結合的DNA片段，并進行純化和文庫構建，然后進行高通量測序，通過將獲得的數據與參考基因組精確比對，研究人員可獲得全基因組范圍內某種修飾類型的特定組蛋白或轉錄因子與基因組DNA序列之間的關系，也可對多個樣品進行差異比較。

應用方向：

ChIP 用來在空間上和時間上不同蛋白沿基因或基因組定位

• 轉錄因子和輔因子結合作用
• 復制因子和 DNA 修復蛋白
• 組蛋白修飾和變異組蛋白

技術優勢：

• 物種范圍廣：細胞、動物組織、植物組織、細菌微生物多物種富集經驗；
• 微量建庫：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開測序分析；
• 方案靈活：根據不同的項目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。

技術路線：

易基因提供全面的表觀基因組學（DNA甲基化、DNA羥甲基化）和表觀轉錄組學（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色質結構與功能組學技術方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻：

Han SH, Ko JY, Jung S, Oh S, Kim DY, Kang E, Kim MS, Chun KH, Yoo KH, Park JH. VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma. Exp Mol Med. 2024 Dec 2. pii: 10.1038/s12276-024-01352-6. doi: 10.1038/s12276-024-01352-6. PubMed PMID: 39617786.

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