溫敏水凝膠因能模擬細胞外基質微環境，且具有原位注射性和形態適應性，在骨組織工程中應用廣泛。小腸黏膜下層（SIS）作為天然細胞外基質來源，富含 I 型和 III 型膠原蛋白及多種生物活性因子，其制備的水凝膠在組織修復中展現出良好潛力，然而其機械性能較弱，在體內復雜應力環境下易坍塌，限制了臨床應用。

此外，骨再生微環境的構建離不開細胞、細胞因子等活性物質的參與，骨髓間充質干細胞（BMSCs）因其自我更新和多向分化能力，在骨損傷修復中具有天然優勢，但直接干細胞移植存在歸巢效率低、潛在致瘤性等風險。

外泌體作為細胞自然分泌的納米囊泡，通過傳遞 mRNA、miRNA 及蛋白質調控細胞間通訊，具有穩定性高、免疫原性低及天然歸巢能力等特點，其中 BMSCs 來源的外泌體（BMSCs-Exs）已被證實具有與親代細胞相似的成骨誘導能力，為無細胞骨修復策略開辟了新途徑。?

盡管外泌體療法優勢顯著，但其在骨再生中的應用仍面臨挑戰。目前外泌體與水凝膠的結合多采用直接混合法，存在負載效率低、外泌體結構易破壞及成骨潛力受抑等問題。為解決這一難題，多功能融合肽作為由多個肽鏈組成的遞送系統，在活性物質靶向遞送中展現出優異性能。

研究表明，CP05 肽（CRHSQMTVTSRL，AbMole，M58139）可特異性識別外泌體表面標志物 CD63，而 TKKTLRT 和 KELNLVY 作為膠原結合域（CBD），能分別與 SIS 水凝膠中的 I 型和 III 型膠原特異性結合。CP05 | AbMole | CRHSQMTVTSRL?此外，剛性連接子 EAAAK 含 α- 螺旋結構，通過氫鍵維持融合肽的結構穩定性，可避免功能域的錯誤折疊。基于此，本研究設計了系列融合肽，通過直接或經 EAAAK 連接 CBD 與 CP05，旨在實現外泌體向 SIS 水凝膠的高效遞送，同時引入 3-（3,4 - 二羥基苯基）丙酸（CA）增強水凝膠的機械性能，最終構建具有優異骨再生能力的新型功能水凝膠體系。?

BMSCs 分離自 SD 大鼠骨髓，采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基在 37℃、5% CO?條件下培養，通過差速離心法分離外泌體：收集無血清培養基，依次經 300×g 離心 15 分鐘、2000×g 離心 20 分鐘去除細胞碎片，0.22μm 濾膜過濾后，100,000×g 超速離心 3 小時獲得外泌體，采用 BCA 法定量蛋白濃度，透射電鏡觀察形態，納米顆粒跟蹤分析（NTA）測定粒徑分布，Western blot 檢測標志物 Alix、CD9、CD63 的表達。?

SIS-CA 水凝膠的制備過程如下：取豬空腸，機械去除黏膜層和肌層，經甲醇 - 氯仿混合液脫脂、胰酶消化、SDS 處理及過氧乙酸滅菌后，凍干并粉碎為絮狀，用 3% 乙酸和 0.1% 胃蛋白酶消化 48 小時制備 10%（w/v）SIS 預凝膠。將 CA 溶解于蒸餾水中配制成 0.5M 溶液，與 SIS 預凝膠混合，用 2.5M NaOH 調 pH 至 7.0，37℃孵育 30 分鐘形成 SIS-CA 水凝膠。融合肽與外泌體的復合體系構建：將 P1 與 P2、P3 與 P4 分別混合（終濃度 200μM），加入 300μL 1μg/μL BMSCs-Exs，隨后將 SIS-CA 水凝膠在 25℃下浸入上述混合液 30 分鐘，獲得 P1&2 SIS-CA/Exs 和 P3&4 SIS-CA/Exs 水凝膠。?

材料表征采用場發射掃描電鏡（SEM）觀察水凝膠微觀結構，凍干樣品經噴金處理后，通過 ImageJ 分析孔徑；傅里葉變換紅外光譜（FTIR）在 4000-500 cm?1 范圍內分析化學組成；萬能試驗機測定力學性能，流變儀評估儲能模量（G'）和損耗模量（G''）的變化；降解實驗中，將水凝膠置于含 100 U/mL III 型膠原酶的 PBS 中，37℃孵育 10 天，按公式計算降解率。外泌體與融合肽的負載情況通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）驗證，外泌體用 DiR 標記，融合肽自帶熒光標記，經 PBS 洗滌三次后觀察熒光分布。?

體外細胞實驗采用 BMSCs，通過 Live/Dead 染色和 CCK-8 法評估細胞活力與增殖；12 和 24 小時的細胞黏附實驗中，用羅丹明 B 標記肌動蛋白，DAPI 染核，CLSM 觀察細胞形態；成骨分化實驗中，通過 RT-PCR 檢測 Runx2、Alp、Opn 的 mRNA 表達，Western blot 和免疫熒光分析相應蛋白水平。外泌體攝取實驗中，DiI 標記的外泌體與細胞共孵育 1 天，CLSM 觀察攝取情況；監測 8 天內膠原酶溶液中累積釋放量。?

動物實驗選用 30 只雄性 SD 大鼠（250-280g），構建 8mm 顱骨缺損模型，隨機分為 5 組：空白組、SIS-CA 組、SIS-CA/Exs 組、P1&2 SIS-CA/Exs 組、P3&4 SIS-CA/Exs 組，每組 6 只。手術中植入相應水凝膠，每周注射一次，12 周后處死大鼠，取顱骨進行 Micro-CT 掃描，分析骨體積 / 組織體積比（BV/TV）等參數；標本經 EDTA 脫鈣、石蠟包埋，切片后進行 HE 染色、Masson 三色染色和 RUNX2 免疫組化分析。?

統計分析采用 SPSS v22.0 軟件，數據以均值 ± 標準差表示，組間比較采用單因素或雙因素方差分析，p<0.05 為差異有統計學意義。?

實驗結果顯示，融合肽的結構預測表明，含 EAAAK linker 的 P3 和 P4 具有更多氫鍵，骨架結構更緊湊，利于 CP05 捕獲外泌體及 CBD 與膠原結合。SIS-CA 水凝膠的 SEM 圖像顯示，CA 的引入使孔隙結構更致密，孔徑從 118.4±38.4μm 減小至 70.5±16.1μm，但對 BMSCs 的浸潤深度無顯著影響（2 天 12μm，4 天 20μm）。FTIR 分析顯示，CA 修飾后酰胺 I 帶（1636 cm?1）位移 1 cm?1，透光率降低，表明 CA 與膠原成功交聯；力學測試中，SIS-CA 水凝膠的最大載荷（2.8±0.12 N）是 SIS 水凝膠的 3 倍，G' 提高 1.4 倍，坍塌應變從 205% 增至 275%，10 天降解率為 70.9%，顯著低于 SIS 水凝膠的 92.4%，證實 CA 有效增強了機械性能和穩定性。?

外泌體表征顯示其呈典型杯狀結構，粒徑 122 nm，表達 Alix、CD9、CD63，不表達細胞溶質標志物 Cytochrome C。CLSM 觀察證實，P3&4 SIS-CA/Exs 水凝膠的 DiR 標記外泌體熒光強度高于 P1&2 組，且分布更均勻，表明含 EAAAK 的融合肽提高了外泌體負載效率。濁度測試顯示，各組水凝膠的膠凝溫度（Tt）無顯著差異，維持了溫敏特性。?

體外實驗中，P3&4 SIS-CA/Exs 組的外泌體 8 天累積釋放量為 54.1±2.0%，高于 P1&2 組的 50.4±1.2%，且在炎癥因子（TNF-α 和 IFN-γ）刺激下仍能穩定釋放。細胞攝取實驗顯示，P3&4 組的外泌體攝取量最多；Live/Dead 染色和 CCK-8 證實該組細胞活力和增殖能力最強；24 小時時細胞呈紡錘形，肌動蛋白絲排列清晰，黏附效果最佳。成骨分化中，P3&4 組的 Runx2、Alp、Opn 的 mRNA 和蛋白表達均顯著高于其他組，表明融合肽與外泌體的協同作用促進成骨分化。?

動物實驗中，12 周的 Micro-CT 顯示 P3&4 SIS-CA/Exs 組的 BV/TV 為（68.3±5.2）%，顯著高于空白組（12.1±3.5）%、SIS-CA 組（32.6±4.1）% 和 SIS-CA/Exs 組（45.8±4.7）%，3D 重建顯示缺損區幾乎被新生骨覆蓋。HE 和 Masson 染色顯示，該組新生骨組織均勻分布，膠原纖維豐富；免疫組化中 RUNX2 陽性區域最大，證實成骨活性最強。?

綜上所述，本研究通過 CA 修飾增強 SIS 水凝膠的機械性能，設計含 EAAAK linker 的融合肽（P3 和 P4）高效錨定外泌體，顯著提高其在缺損部位的保留與穩定性，協同促進 BMSCs 的增殖和成骨分化，在大鼠顱骨缺損模型中實現了優異的骨再生效果。該體系為骨組織工程中的無細胞策略提供了新思路，具有潛在的臨床應用價值。在實驗過程中，所用到的部分試劑如用于細胞培養和檢測的相關產品，其品質保證為實驗的順利進行提供了支持，其中 AbMole 的產品在相關步驟中發揮了重要作用，確保了實驗結果的可靠性。