生信軟件47 - 超低測序深度的全基因組測序cfDNA腫瘤分數估計工具ichorCNA

1. ichorCNA簡介

ichorCNA是一種用于估計來自超低測序深度的全基因組測序（ULP-WGS，0.1x覆蓋率）的cfDNA中腫瘤分數的工具。ichorCNA使用概率模型，應用隱馬爾可夫模型（HMM），以同時分割基因組，預測大范圍的拷貝數變化，并估計超低深度全基因組測序樣本的腫瘤分數。ichorCNA針對樣品的超低深度（~0.1x）測序進行了優化，并且已經使用患者和健康供體cfDNA樣品進行了基準測試。

ichorCNA分析工作流包括2個任務：

（1）GC含量偏倚校正（使用HMM copy），從ULP-WGS計算reads覆蓋率，數據校正和標準化；

（2）CNA預測和cfDNA的腫瘤分數的估計。

2. 軟件安裝

########## 推薦安裝 #########
# R包安裝,軟件是否升級，選擇3： None
install.packages("devtools")
devtools::install_github("broadinstitute/ichorCNA")########## 手動安裝（R≥3.6.0） #########
git clone git@github.com:broadinstitute/ichorCNA.git  install.packages("plyr") # 安裝依賴包
BiocManager::install("HMMcopy")  
BiocManager::install("GenomeInfoDb")  
BiocManager::install("GenomicRanges")  # SHELL
R CMD INSTALL ichorCNA

3. 軟件用法

ichorCNA可用于告知腫瘤來源的DNA的存在或不存在，并指導進行全外顯子組或更深的全基因組測序的決定。此外，腫瘤分數的定量估計可用于校準期望的測序深度，以達到用于鑒定游離DNA中的突變的統計。

教程： https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/wiki

3.1 生成讀取計數文件

使用HMMcopy套件中的readCounter生成讀取計數覆蓋率信息；從ULP-WGS BAM創建WIG文件，使用HMMcopy的readCounter工具。下面示例將創建跨所有染色體具有1 Mb箱的WIG文件，并且僅包括具有大于20的比對質量的reasd。

# BAM索引
samtools index tumor.bam# raeds計數
/HMMcopy/bin/readCounter --window 1000000 --quality 20 \
--chromosome "1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,X,Y" \
tumor.bam > tumor.wig

3.2 CNV分析和腫瘤分數的預測

使用ichorCNA R軟件包的拷貝數分析和腫瘤分數的預測,runIchorCNA.R R腳本位于ichorCNA/scripts/目錄中。

Rscript /ichorCNA/scripts/runIchorCNA.R \
--id tumor_sample \
--WIG tumor.wig \
--ploidy "c(2,3)" \
--normal "c(0.5,0.6,0.7,0.8,0.9)" \
--maxCN 5 \
--gcWig /ichorCNA/inst/extdata/gc_hg19_1000kb.wig \  # GC含量wig文件
--mapWig /ichorCNA/inst/extdata/map_hg19_1000kb.wig \  # 比對分蘇的wig文件
-centromere /ichorCNA/inst/extdata/GRCh37.p13_centromere_UCSC-gapTable.txt \  # 包含著絲粒位置的文件
--normalPanel /ichorCNA/inst/extdata/HD_ULP_PoN_1Mb_median_normAutosome_mapScoreFiltered_median.rds \   # normal面板的中值矯正深度
--includeHOMD False \
--chrs "c(1:22, \"X\")" \ # 指定分析的染色體
--chrTrain "c(1:22)" \    # 指定用于估計參數的染色體
--estimateNormal True \
--estimatePloidy True \
--estimateScPrevalence True \
--scStates "c(1,3)" \
--txnE 0.9999 \
--txnStrength 10000 \
--outDir ./  # 輸出目錄

3.3 創建自定義的參考面板（可選）

https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/wiki/Create-Panel-of-Normals

ichorCNA 可以在沒有任何參考面板的情況下運行。作者提供了一個帶有 ichorCNA 的正常組（PoN），但使用與你的癌癥患者 cfDNA 樣本類似的處理和測序的樣本生成你自己的樣本可能會降低噪音并提高準確性。這些數據有助于進一步標準化癌癥患者的 cfDNA，以糾正由文庫構建、測序平臺和 cfDNA 特異性偽影引起的系統性偏差。

3.4 低腫瘤含量樣本（早期疾病）的參數優化

對于預期腫瘤分數低于 5% 的樣品，修改默認設置以改善參數估計可能會有所幫助。對于這些類型的樣品，建議對更高的覆蓋度（> 1-5x）進行測序。對于預期腫瘤分數低于 ~0.5% 的樣本，我們建議使用標準深度的全基因組測序（例如 > 20 倍）。

3.4.1 初始化腫瘤分數參數

將非腫瘤（1 減去腫瘤分數）初始化為預期值，例如 5%、1%、0.5%、0.1%。ichorCNA 仍將估計腫瘤分數，但擁有這些初始起始值可以幫助 EM 步驟找到更好的全局最優值。

--normal "c(0.95, 0.99, 0.995, 0.999)"

3.4.2 將初始倍性設置為二倍體

對于低腫瘤分數病例，很難預測倍性值。

--ploidy "c(2)"

3.4.3 減少拷貝數狀態的數量

減少狀態空間將有助于降低復雜性。如果您從先前的樣本（例如腫瘤活檢）中知道存在較大的高水平拷貝數事件，則可以將其設置為 4。

--maxCN 3

3.4.4 不考慮亞克隆拷貝數事件

對于低腫瘤分數，亞克隆事件很難檢測到，這些我們可以關閉。

--estimateScPrevalence FALSE --scStates "c()"

3.4.5 僅訓練和分析常染色體

在分析和訓練中排除 chrX 以降低復雜性。

--chrs "c(1:22)" --chrTrain "c(1:22)"

3.5 snakemake管道

https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/wiki/SnakeMake-pipeline-for-ichorCNA

此工作流將從 BAM 文件開始運行 ichorCNA 管道并生成 ichorCNA 輸出。

4 主要輸出文件

<sampleID>.seg : 由 Viterbi 算法調用的 Segment。格式與 IGV 兼容。<sampleID>.seg.txt: 與 <sampleID>.seg 相同，但還包括節段的亞克隆狀態（0 = 克隆，1 = 亞克隆）。格式與 IGV 不兼容。<sampleID>.cna.seg: 每個 bin/窗口的估計拷貝數、日志比率和子克隆狀態。<sampleID>.correctedDepth.txt： 校正 GC 和可映射性偏差后每個 bin/window 的 Log2 比率。<sampleID>.RData： ichorCNA 完成后保存的 R 圖像。將包括所有解決方案的結果。<sampleID>/<sampleID>_CNA_chr#.pdf： 每條染色體的拷貝數圖。<sampleID>/<sampleID>_bias.pdf： 說明 GC 和可映射性偏差校正之前/之后的數據的圖表。<sampleID>/<sampleID>_correct.pdf：GC 和可映射性偏差校正之前/之后的全基因組數據圖。<sampleID>/<sampleID>_genomeWide_n##-p#.pdf：用 n 和 p 初始化的溶液的估計拷貝數、腫瘤分數和倍性注釋的數據全基因組圖。p=腫瘤倍性<sampleID>/<sampleID>_genomeWide.pdf：全基因組數據圖，注釋了估計的拷貝數、腫瘤分數和倍性，以獲得最佳解決方案。<sampleID>/<sampleID>_tpdf.pdf：使用來自最優解的收斂參數繪制每個拷貝數狀態的 students-t 分布圖。Tumor Fraction 腫瘤分數，腫瘤來源的DNA的估計分數。相當于大量腫瘤分析中的純度。Tumor Ploidy 腫瘤倍性，腫瘤來源基因組的平均拷貝數。總體樣本倍性為 2 * (1 - tumor.fraction) + tumor.fraction * tumor.ploidy。

參考文獻：
Adalsteinsson, Ha, Freeman, et al. Scalable whole-exome sequencing of cell-free DNA reveals high concordance with metastatic tumors. (2017) Nature Communications Nov 6;8(1):1324. doi: 10.1038/s41467-017-00965-y