近日，希臘亞里士多德大學塞薩洛尼基分校的研究團隊在《神經科學方法》（Journal of Neuroscience Methods）期刊上發表了一項引人注目的研究，他們開發了一種基于新生大鼠腦組織的新型類器官培養協議，并展望其在阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）研究中的應用前景。這項研究不僅揭示了大腦發育的奧秘，更為神經退行性疾病的研究提供了新的思路。
Y-27632 dihydrochloride | 129830-38-2 | AbMole | Y27632; Y-27632 2HCl
研究背景：從二維到三維的跨越
在傳統的研究中，科學家們往往依賴于二維細胞培養模型來探索細胞的生物學特性。然而，這種模型在模擬復雜生物系統方面存在明顯的局限性，尤其是在研究大腦這樣高度復雜且多維度的器官時。為了更真實地模擬大腦環境，三維細胞培養系統應運而生，其中類器官作為最具代表性的模型之一，正逐漸成為神經科學研究的新寵。
類器官是由干細胞或多能干細胞在特定條件下自發組織形成的三維細胞團塊，它們能夠模擬體內器官的部分或全部功能。在神經科學領域，腦類器官因其能夠模擬大腦的三維結構和細胞間的復雜相互作用而備受關注。然而，當前腦類器官的培養協議多依賴于干細胞誘導分化，不同協議間因使用的生長因子不同而導致類器官組成各異，這在一定程度上限制了其一致性和可重復性。
研究創新：基于新生大鼠腦組織的類器官培養
為了克服現有培養協議的局限性，研究團隊提出了一種新穎的培養方法，旨在利用新生大鼠（3天齡）全腦組織中的多樣化細胞類型，通過一步法酶解消化和三維培養，快速生成結構一致、功能完整的腦類器官。
詳細protocol流程
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實驗材料準備：研究團隊精心準備了包含多種營養因子的DMEM/F12培養基，如GlutaMax、Hepes、青霉素/鏈霉素等，以確保細胞的健康生長。同時，他們還準備了用于后續細胞類型鑒定和功能分析的一系列高質量抗體。
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實驗動物處理：實驗選用了Wistar大鼠的3天齡幼崽，通過無麻醉的斷頭法處死，迅速收集腦組織。在無菌條件下，研究團隊仔細去除了腦膜、血管等雜質，確保后續實驗的準確性。
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細胞分離與培養：將收集到的腦組織切成小塊后，研究團隊利用酶解消化法將其分解成單細胞懸液。經過過濾和離心處理后，這些細胞與基底膜提取物（BME）按一定比例混合，并均勻接種于培養板中。在含有豐富營養物質的培養基中，這些細胞逐漸生長并形成半球形的類器官結構。整個培養過程持續28-32天，期間需要定期更換部分培養基以維持細胞的健康生長。
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類器官鑒定與功能分析：為了驗證類器官的結構和功能特性，研究團隊進行了一系列精細的實驗。首先，通過蘇木精-伊紅染色（HE染色），他們觀察到了類器官中細胞的有序排列和致密結構。接著，利用多種特異性抗體（如抗NeuN用于標記神經元、抗GFAP用于標記星形膠質細胞、抗Iba1用于標記小膠質細胞、抗SOX2用于標記神經干細胞等），研究團隊通過免疫熒光染色技術清晰地展示了這些細胞在類器官中的分布和形態。此外，他們還通過Western blot分析檢測了類器官中多種與阿爾茨海默病密切相關的蛋白表達水平（如APP、Aβ、tau、GFAP以及IL-1β等），并進一步探討了類器官對神經炎癥的響應性。
實驗結果與分析：類器官的“大腦”特性初現端倪
研究團隊通過一系列精心設計的實驗，深入探討了新生大鼠腦類器官的結構和功能特性。HE染色結果顯示，類器官呈現出致密的細胞結構和有序的組織排列，這表明它們已經初步具備了大腦的某些特征。更重要的是，免疫熒光染色和Western blot分析結果顯示，類器官中包含了多種與大腦功能密切相關的細胞類型（如神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和神經干細胞等），并且這些細胞能夠表達多種與阿爾茨海默病密切相關的蛋白（如APP、Aβ、tau等）。此外，在脂多糖（LPS）刺激下，類器官中炎癥因子IL-1β的表達水平顯著上調，這表明類器官對神經炎癥具有敏感的反應性。這些結果不僅證明了類器官在結構上與大腦具有相似性，也為其在功能上模擬大腦提供了有力支持。
研究意義：開啟神經科學研究新篇章
這項研究的意義在于它提出了一種簡單、高效且成本效益高的類器官培養協議，為神經科學研究提供了新的工具和方法。與傳統的干細胞誘導分化方法相比，這種基于新生大鼠腦組織的培養協議無需使用多種生長因子和復雜的培養條件即可生成結構一致、功能完整的腦類器官。這不僅降低了實驗成本和時間成本也提高了類器官的一致性和可重復性。此外該研究還展示了類器官在阿爾茨海默病研究中的潛在應用前景為探索該疾病的發病機制提供了新的思路和方法。
未來展望：探索大腦的無限可能
展望未來隨著生物技術的不斷進步和類器官培養技術的不斷完善我們有理由相信類器官將在神經科學研究中發揮越來越重要的作用。通過進一步優化培養協議和引入更先進的分子生物學技術（如CRISPR-Cas9基因編輯技術）科學家們可以生成更加復雜和多樣化的類器官模型來模擬不同的大腦區域和疾病狀態。這將有助于我們更深入地理解大腦的生理和病理機制以及神經退行性疾病的發病機制。同時類器官還可以作為藥物篩選和毒性測試的平臺來加速新藥研發進程為治療神經退行性疾病提供新的希望。
以下是一種大鼠腦類器官開發的?protocol：
一、材料與方法
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培養基：使用 Advanced DMEM/F12 培養基，添加 GlutaMax、Hepes、青霉素/鏈霉素、Primocin、R-spondin、B27 補充劑、N-乙酰半胱氨酸、SB 202190、A83-01、煙酰胺、Y-27632、Noggin、FGF-7 和 FGF-10 等成分。
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實驗動物：3 日齡的 Wistar 大鼠幼崽。
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細胞分離：將幼崽斷頭處死后，迅速取出大腦組織，用膠原酶 II 處理以分離細胞，通過過濾和離心獲得單細胞懸液，再用紅細胞裂解緩沖液去除紅細胞。
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類器官培養：將細胞與基底膜提取物（BME）按 1:1 混合，接種于 24 孔板中，37℃、5% CO?培養箱中培養，每 3 天部分更換培養基，培養至 32 天。
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LPS 處理與細胞裂解液制備：用 1μg/ml 的 LPS 處理培養 32 天的類器官 24h，收集培養基和細胞裂解液進行后續分析。
二、結果與分析
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類器官生成與細胞類型鑒定：培養 28 天的類器官經蘇木精 - 伊紅染色顯示結構完整，免疫組化證實存在神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和祖代干細胞。
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類器官功能驗證：Western Blot 分析顯示類器官表達了神經元和膠質細胞的特異性蛋白，如 APP、MAPT、GFAP 等，并能分泌 Aβ 和 IL-1β。
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LPS 誘導的 AD 相關蛋白表達與炎癥反應：LPS 處理后，類器官中 APP、Aβ、GFAP、MAPT 和 IL-1β 的表達水平顯著升高，表明類器官對炎癥刺激產生了類似于 AD 的病理反應。
三、優勢與應用
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優勢：該 protocol 簡單，生成的類器官結構一致，無需使用影響結構和功能的可變因素，為研究神經退行性疾病提供了有價值的工具。
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應用：可用于研究阿爾茨海默病的病理生理機制，篩選潛在的治療藥物等。
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