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在工業應用領域，α-半乳糖苷酶在食品加工、動物營養及醫療等方面發揮著重要作用。然而，微生物來源的該酶往往存在熱穩定性不足的問題，限制了其在工業場景中的高效應用。近日，來自江南大學的團隊在《International Journal of Biological Macromolecules》發表最新研究，通過多維計算策略成功提升了米曲霉 α-半乳糖苷酶的熱穩定性與催化效率，為工業酶的分子改造提供了新范式。
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結果速覽
1. 雙策略框架：計算工具與分子模擬的協同創新
①策略一：多工具整合的突變庫設計
利用?ABACUS2、PROSS、DBD2?等計算工具構建突變庫，通過 Consurf 和 GREMLIN 分析序列保守性，結合 FoldX 計算展開自由能變化（ΔΔG）和 PROSS 的位置特異性評分矩陣（PSSM）篩選突變位點。最終獲得優勢突變體A169P，其在 pH 4.0、55℃條件下的熱半衰期提升 78.52%（從 10.57 分鐘延長至 18.87 分鐘），催化效率（Kcat/Km）提高 52.04%。
圖1. 多維計算策略流程圖
②策略二：分子動力學與機器學習的聯合預測
通過 GROMACS 進行 100 ns 分子動力學模擬，識別出 50 個高波動位點（RMSF>0.13），結合 Rosetta 的 cartesian_ddg 計算和 SPIRED 機器學習模型（SPIRED-Stab/SPIRED-Fitness），篩選出 E429I、N380L、T64P 三個穩定變體。其中，E429I 和 T64P 的熱半衰期分別延長 57.33% 和 41.34%，同時催化效率提升 85.25% 和 65.90%。
圖2. 分子動力學模擬結果，顯示高波動位點篩選過程
2. 關鍵機制：結構穩定與催化性能的平衡
① 局部構象優化與疏水作用增強
突變體 A169P 和 T64P 通過引入脯氨酸（Pro）強化環區剛性，減少局部構象波動。例如，A169P 位于非催化區域，通過穩定酶的催化構象間接提升活性；E429I 通過將親水谷氨酸替換為疏水異亮氨酸，促進 C407-C430 二硫鍵的形成與維持，增強整體穩定性。
圖3. 突變位點的分子結構分析，顯示了脯氨酸對環區的剛性作用
②底物特異性與動力學優化
針對 pNPG 和棉子糖兩種底物的動力學分析表明，A169P 和 E429I 均顯著降低米氏常數（Km），提升底物親和力。其中，E429I 對 pNPG 的(Kcat/Km)提升 85.25%，歸因于其增加的親水性表面積（SASA）改善了溶劑相容性。
圖4. 酶-底物復合物的分子動力學模擬，對比野生型與突變體的結合穩定性
傳統定向進化需篩選大量突變體，而本研究通過計算策略將突變庫規模從數千縮小至數十個，顯著降低實驗工作量。例如，策略一通過多指標過濾（保守性評分、ΔΔG<-0.5、PSSM≥0）將初始 236 個突變精簡為 18 個候選，最終僅需驗證 5 個高潛力突變體。
α-半乳糖苷酶在飼料加工中需耐受高溫制粒過程，而野生型酶易失活。優化后的突變體在 pH 4.0（模擬動物胃腸道酸性環境）和 55℃條件下表現出顯著穩定性，可有效降解大豆粕中的抗營養因子（如棉子糖家族寡糖），提升飼料消化率。
總結
該研究整合序列保守性分析、分子動力學模擬、機器學習預測等多維計算工具，建立了酶分子設計的通用框架。未來，結合更多元的算法（如深度學習預測蛋白質 - 配體相互作用）和實驗驗證，有望進一步加速工業酶的功能優化，推動綠色生物制造技術的發展。
