中國中醫科學院中藥研究所在《Environmental Microbiome》期刊上(IF=7.9)發表了關于葉際真菌微生態網絡的文章，該研究通過對ITS測序結果和環境因子測定結果以及皂苷含量測定結果進行生信分析，提出了維持微生態網絡的穩定性策略和影響皂苷含量的因素。
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期刊：?Environmental Microbiome
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影響因子：?7.9
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?發表時間：?2023.07
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樣本類型：?人參葉片
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DOI:?10.1186/s40793-023-00516-7
研究背景
葉際微生物群在植物的健康、生長和生物地球化學循環中起著至關重要的作用。但對葉際真菌群落的認識仍然缺乏，文章利用葉際真菌形成的復雜微生物生態網絡(MENs：microbial ecological networks)在群落結構維持策略及其對植物次生代謝的貢獻方面進一步展開研究，以便更全面地了解葉際生物圈及其在植物健康和生態中的作用。
文章亮點
本文研究了MENs中的模塊及其與人參葉片中皂苷分布和總皂苷積累的聯系，探索了可能促進三種人參皂苷積累的不同真菌群落之間的關系，為更好地了解植物-真菌相互作用的進化特征做貢獻。
實驗設計
在年平均氣溫為2.9~3.2℃的吉林省采樣人參(PG：P. ginseng)和西洋參(PQ：P. quinquefolium)種子，并在云南（16.3~16.7°C）采集三七(PN：P. notoginseng)，將采集的三種人參種子進行規范化種植和管理。
圖?三種人參的取樣地點和相應的年平均溫度
在3個種植2年、3年和4年生植物的人工林中，在每個人工林中3種人參各采集了90株健康植株。每種人參共采集270株植物。三種人參共810株。并測量環境因子數據和皂苷含量數據。
圖?技術路線
實驗結果
1、潛在的生物相互作用是真菌MENs連接的主要驅動因素
對樣本進行二代ITS測序，選取相對豐度高于0.01%的真菌ASVs序列計算Spearman相關性，共構建關于3種植物2個隔室的6個網絡，發現所有的MENs都以正連接為主(圖1a)。進一步估計網絡連接的潛在驅動因素，人參葉際真菌MENs之間的相互作用可能對現有連接貢獻最大（圖1b）。
圖1?真菌MENs和不同驅動因素對網絡連接的相對貢獻
2、人參葉際真菌MENs穩定性高但效率低
為了探究真菌MENs維持穩態的原因，文章對確定性與隨機性網絡圖的網絡特性進行比較，并采用Zi -Pi框架觀察節點分布，與隨機網絡相比，確定性網絡有明顯較低的全局效率和較高的avgL（邊平均最短長度）(圖2a-b)，而且確定性網絡有明顯更高的魯棒性(圖2c-d)。另外，在所有MENs中，只有少數節點確定為連接節點，并且沒有節點被確定為網路中心節點(圖2e)。表明人參葉際真菌MENs傾向于采用與中心無關的高魯棒性策略，并犧牲網絡效率來維持結構穩定。
圖2 確定性與隨機網絡的網絡特性比較以及Zi -Pi分析
3、網絡模塊有助于形成人參葉中的皂苷譜
計算了6個MENs中27個模塊在5個及以上節點的模塊屬性（表示每個模塊內所有ASVs相對豐度變化），分別對模塊屬性、環境因子與皂苷譜Sam變化進行Spearman相關分析，確定促進不同類型皂苷積累的候選模塊（與皂苷變化顯著正相關的模塊為候選模塊）和候選環境因子。將圖2a、b、c的結果如表1所示。
| 候選模塊 | 候選環境因子 | ||||||||||||
| PG | PQ | PN | PG | PQ | PN | ||||||||
| MENs | LE | LP | LE | LP | LE | LP | MENs | LE | LP | LE | LP | LE | LP |
| 候選 模塊 | M1、M2 | M1、M2、M3 | M1、M3 | M1、M3 | M1、M5 | M1 | 候選環境因子 | OC、AK、NIN、MC和Ca | pH、AMN和MC | pH、AMN和MC | |||
表1 促進皂苷積累的候選模塊和候選環境因子
為了評估真菌網絡模塊對人參葉片皂苷變化的貢獻。用隨機森林分析和k近鄰回歸兩種機器學習算法各構建四個模型，用MSE（真實觀測響應與預測響應之間的均方誤差）和Spearman ρ評估模型性能。在兩種機器算法中，包含候選真菌網絡模塊的模型表現更好(圖3d-e)。
圖3?真菌網絡模塊對葉片皂苷譜的貢獻度
4、PRMs與人參之間存在更緊密的聯系
與總皂苷含量呈正相關的ASVs數量超過一半的候選模塊被確定為皂苷積累的正調節模塊(PRMs)。皂苷積累的正調節模塊(PRMs)比相同MEN中的其他模塊節點的中心度更高（圖4a），表明這些節點在群落結構中處于更中心的位置。此外，與其他節點相比，植物相關真菌群落（如植物病原體、內生菌等）在PRMs中的比例通常更高，這表明PRMs和人參之間的聯系更緊密（圖4b）。生態組裝機制(NST)的研究也支持上圖結論(圖4c)。
圖4?正向調節模塊與其他網絡成員在拓撲重要性、植物依賴因素和生態組裝方面的比較
基于之前的模型，SEM可以評估PRMs在所有皂苷積累是否重要（圖5a），χ2檢驗、CFI和RMSEA算法均適合三種人參葉際真菌網絡模型(圖5b-d)。PG中，LP中的M3對總皂苷含量有顯著且直接的影響(圖5b)。葉際真菌網絡模塊對總皂苷積累有直接的影響(圖5c和d)。
圖5?正調節模塊（PRMs）對總皂苷影響的結構方程模型
5、特異且保守正調控類群有助于人參總皂苷積累
在SEM驗證的正調控模塊中，與總皂苷含量呈顯著正相關的節點被確定為葉片皂苷積累正調控類群(PRT)。6個MENs富集分析表明，Pleosporales在三種人參物種的網絡中都能觀察到，而Chaetothyriales僅在PN的MENs中出現(圖6a)。此外，幾乎所有PG網絡中的正調控類群（PRT）都與PQ和PN的PRT有親緣關系(圖6b)；在目水平上，PQ和PN分別具有明顯的分類學特異性。總之，這些結果揭示了真菌分類群的特異性和保守性，這可能有助于葉總皂苷在三個人參物種中的積累。
圖6?三種人參植物正調控微生物群的富集和分布圖
研究結論
綜上所述，本研究揭示了葉際真菌群落的高魯棒性但低效率的網絡特征，驗證了網絡模塊對人參葉片皂苷譜和總皂苷含量的貢獻。這些發現，為理解植物葉層菌群維持穩定的機制奠定了基礎。
參考文獻
Zhang GZ, et al. Modules in robust but low-efficiency phyllosphere fungal networks drive saponin accumulation in leaves of different Panax species. Environmental Microbiome.2023.
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