摘要：

增強抗體親和力對于提高其檢測靈敏度,延長解離時間,降低藥物使用劑量和增強藥效都具有非常重要的意義.到目前為止,提高抗體親和力的方法主要是以原親本單抗為改造模板,通過構建其突變體抗體庫(如核糖體展示,酵母雙雜交,噬菌體展示抗體庫等)進行篩選,最終獲得更高親和力的單抗.但是這些技術具有很大的局限性:很難構建出足以覆蓋所有位點的,突變成任何氨基酸的突變文庫;構建抗體庫及其篩選過程費時費力;當目標蛋白難以表達或者在體外篩選的環境下結合不穩定的時候,就難以采用抗體庫的方法進行篩選.最近,通過計算機輔助設計的方法來提高抗體親和力的技術成為新興的熱點.與以往的抗體庫技術相比,計算機輔助設計可以通過虛擬突變的方法來進行篩選,大大節約了實驗所用時間;可對抗體結合域所有位點進行單點和組合虛擬突變;其預測突變的氨基酸往往只有一個就可以顯著提高抗體親和力.但現有的計算機輔助設計方法還存在準確率低和計算量過大的問題.因此,在本研究中,我們在計算機輔助設計的過程中率先引入了蛋白質相互作用,特別是抗原抗體相互作用的經驗規律,借助于模擬退火及能量最小化等計算機模擬的方法,高效快速的提高了兩個親和力成熟抗體的親和力. 在前期已獲得Rituximab和CD20抗原肽共結晶的基礎上,首先對Rituximab進行提高親和力的研究.由于其對應的抗原肽僅僅為僅有44個氨基酸的短肽,其接觸的溶劑化接觸面積較小,在其接觸表面上僅僅選取3個位置進行有目的的計算,每個位置分別突變為候選的7個其他氨基酸并進行模擬計算,通過對模擬點突變后的抗原抗體復合物進行模擬退火和能量最小化并對最終的模擬結構進行評價,最終在每個位置分別選取了3個預測提高的氨基酸,采用定點突變技術進行點突變,經測序后將序列正確的抗體輕,重鏈基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+),最后將構建好的輕,重鏈表達載體共同瞬轉CHO細胞并用流式細胞術檢測比較各抗體突變體的親和力.實驗表明了預測親和力提高和降低的準確率達到了75%以上.最終在每個位置上分別選取能夠提高抗體親和力的氨基酸進行組合突變,最終獲得了更高親和力的抗體.在進行Trastuzumab抗體的突變過程中,由于其與Her2抗原的接觸面積較大(675A),因此在其表面上分別選取了9個位置作為候選的突變位點進行計算機模擬點突變,借助上述計算機模擬方法,隨機選取了一些預測能夠提高的位置進行模擬準確性的評價.借助于分子定點突變手段,最終通過流式檢測親和力的變化,證明了預測準確率達到了77%.由于采用這種基于晶體結構分析基礎上選取有限的幾個位置進行有限的七到八個氨基酸的突變體的計算,改變了以前通常采用的對接觸面上所有的氨基酸進行突變計算突變成其他20種氨基酸的計算策略,不但大大減少了計算機運算的時間,使得以前需要在大型機上幾個月的時間縮短到僅僅在圖形工作站上幾個星期就能夠完成,而且大大提高了預測的準確率,大大縮短了進行實驗摸索的時間.抗體功能的發揮不僅僅與親和力有著密切的關系,而且與抗體的表位密切相關.通過有目的的改造,可以在不改變抗體表位的基礎上,僅僅改變幾個氨基酸就能夠較大的提高抗體親和力,最大限度的延長現有治療性抗體的應用周期.對計算機輔助設計改造蛋白質親和力的嘗試,對于其在蛋白質設計領域更廣泛的應用具有潛在的指導價值.

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