大腸桿菌原核表達實驗心得（上篇）
對于大腸桿菌蛋白表達，大部分小伙伴都覺得 so easy! 做大腸桿菌蛋白表達十幾年經歷的老司機還經常陰溝翻船，被大腸桿菌表達蛋白虐千百遍的慘痛經歷，很多小伙伴都有切膚之痛。
福因德接下來陪你聊聊大腸桿菌表達重組蛋白里面的彎彎道道，拿到一個項目，我們要從以下方面入手。1. 蛋白基本性質分析
所謂知己知彼百戰不殆。如果不熟悉其性質，隨便找一篇文獻或者問問師兄師姐照葫蘆畫瓢，找一個載體隨便上，這樣如果成功純粹就是碰運氣。我們經常碰見這樣的案例，一個氨基酸的突變極有可能造成蛋白表達的不成功、表達狀態改變或者降解加速。
那我們分析蛋白質的性質，該從何下手呢？很多初學者往往一頭霧水。我們主要從蛋白質分子量、親水性、蛋白質修飾情況、蛋白跨膜區、蛋白質等電點、蛋白質在本物種體內的存在環境以及是否是酶等等。1）分子量：分子量太大或太小都不易表達。分子量太小容易降解，太大不易表達，任何一個位置氨基酸或者結構有問題，都會影響整個蛋白。2）親水性：一般來說親水性較好的蛋白比較易于表達，并且容易可溶性表達，這個親水性可以通過軟件預測，比如 DNastar 的 Protean（軟件及其使用方法，可以聯系 QQ657047932 索取）；通過這個軟件我們同時可以看到蛋白抗原性預測基本與這個親水性趨勢一致，所以準備拿這個蛋白制備抗體的小伙伴是不是很開心？3）蛋白質修飾情況：在 Uniprot 網站查到這個蛋白之后，這里面信息量很大，如果蛋白修飾比較多的話，這個蛋白不容易表達或者表達的狀態不容易為上清可溶性，原因是大腸桿菌內表達這個蛋白是沒有修飾的，蛋白的修飾與不修飾，理化性質肯定是不同的，這些都會使你的原核表達遇到障礙。4）蛋白質跨膜區：跨膜區域一般是親脂疏水的，這些部分多了對蛋白的順利表達極為不利；即使蛋白可以順利表達，下游純化也是極為不利。5）蛋白質等電點問題：如果溶液環境與蛋白質等電點相同或者接近，蛋白質非常容易沉淀。6）蛋白質在本物種體內的存在環境：環境變了，蛋白質很可能「水土不服」，某個蛋白在同一個個體，不同部位，不同發育時期，其變現狀態有可能都大不相同，這些不同包括修飾位點和程度，蛋白序列長短等等；普通大腸桿菌細胞內這個溶液環境是還原性的，對于需要二硫鍵對接的蛋白根本完不成這個使命，需要格外注意。7）蛋白本身是否是酶或者活性蛋白：如果你的目標蛋白本身是酶或者活性蛋白，不但自身不穩定還會「惹事生非」，我們有時候稱她們為「毒性蛋白」，這個時候一般會選用極度嚴謹型表達。
下篇我們繼續講大腸桿菌重組表達表達策略問題...