做完轉錄組分析之后，一般都要求做qRT-PCR來驗證二代測序得到的轉錄本表達是否可靠。熒光定量PCR是一種相對表達定量的方法，他的計算方法有很多，常用的相對定量數據分析方法有雙標曲線法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計算；
qRT-PCR原理：
以基因的cDNA為模板進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以可以定量。
Ct值是什么意思呢？
Ct 值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數 (cycle)。 qRT-PCR在擴增的時候都會有平臺期，在平臺期之前，PCR 擴增就是簡單的指數增長，也就是 1 變 2，2 變 4，4 變 8 …擴增。數學形式就是 2 的 ct 次方，到了平臺期所有基因擴增的數目是一致的，而唯一有區別的則是 ct 值的不同。所以不難推斷出 ct 值越小，反應擴增到達平臺期所需循環數越少，目的基因起始含量越高。這里可以得到公式：
計算-ΔΔCt
在這里，我們有一個對照組，一個處理組，還有一個內參基因和目的基因，想看一下目的基因在處理組中相對與對照中的表達差異，也就是計算-ΔΔCt：數據如下：
1.計算每組內參基因sgAction Ct均值
2.計算第一個 Δct，即每組的待檢目的基因減去內參基因的 Ct 值
3.計算對照CK組中 Δct 的均值，再用處理組的 每一個Δct 減去剛剛計算的對照CK組的 Δct 均值，得到 ΔΔct（紅框框）
4.相對表達量計算，也就是相對于對照組: 2^-ΔΔct：
不難看出這里的-ΔΔct和我們轉錄組當中的log2（fold change）值是一致的，所以如果多做幾個基因就可以繪制類似如下圖：
或者相關性點圖：
方法二：
qPCR疑問解答：
qPCR經驗之談~?mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU4MDkwMDg1NQ==&mid=2247485292&idx=2&sn=3c3b4a6bc081cad3cf9885a558a5b0cc&chksm=fd4e85f4ca390ce292c362a65a1b4aa96cd588c81175d31d67591f0fcbafb62d15a7ede436cb&payreadticket=HLmElvoD9e7mLxIpkqmCec18xG7Dn_wCNHcnclCAdTcn6VUED2d3Nf1g8e59r3yddyk0CtA#rd?編輯
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2–??Ct 是一種計算實時熒光定量PCR（qPCR）時候計算樣品中某個基因的相對表達量的方法。該法由Kenneth Livak和Thomas Schmittgen于2001年設計，已經被廣泛使用。
Ct值代表了樣品的循環閾值，這是在跑熒光定量PCR的時候，機器反饋給你的一個數值。真正的含義是PCR過程中產物擴增出現的熒光信號達到了設定的閾值之后，對應的循環數。例如 Ct = 19，說明這個產物擴張到第19個循環的時候才達到了設定的熒光閾值。也就可以側面反映這個PCR時候模板的起始濃度，濃度越高，Ct值出現得越低。
delta：意思是兩個值之差
上面的公式就是用實驗組的 ΔCt 減去 空白組的?ΔCt得到的 ΔΔCt?。
而 ΔCt 由以下公式得到：
管家基因，也就是內參基因。ΔCt是用目的基因的Ct減去內參基因得到的差值。
什么是管家基因/內參基因？一般是指不受時空等其他因素影響，始終能穩定高表達的一類基因。常用的有β-Actin、GAPDH、18S、UBQ、EF-1α、TIP41。
- β-Actin：β-肌動蛋白
- GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶
- 18S：18S核糖體RNA
- EF-1α：延伸因子-1α
- UBQ：泛素酶
如果你有一個內參基因，可以參照以下案例進行計算：
這是一份具有兩個重復的qPCR的Ct值，分別為Ct1和Ct2，housekeeping gene為管家基因，另一個是你需要研究的基因。
1. 平均化技術重復的Ct值。則求每個樣品的Ct1和Ct2的平均值，可得：
2. 計算每個樣品的ΔCt值。如Control 1（空白對照組1）的ΔCt為：
所有樣品的ΔCt值如下：
3. 選擇一個校準/參考樣品用來計算ΔΔCt
用哪個樣品或者樣品組作為校準或參考，這一步會迷惑許多人，但其實取決于你的實驗設置。
一般來說你可以將任意一組作為校準/參考都是可以的，也就是說你用Control或Treated，但是一般我們會用空白對照組為標準，研究實驗處理的基因表達量變化。或者如果是研究不同品種之間的基因表達量，一般不用研究的那個品種作為標準。
還有一種方法就是選擇用Ct值較高的一組作為參考組。
這里選擇用Control組的生物學重復計算平均的ΔCt值作為參考，也就是：
值得注意的是，如果在計算平均ΔCt的時候，每個ΔCt變化較大，這時候不建議用算數平均值，而選擇用幾何平均值，這樣會更好處理我們的異常值。例如這里的Control組Ct值是：13.38、13.60和15.80時，我們選擇用幾何平均值：
4. 計算ΔΔCt值。用每個樣品所得的ΔCt減去第三步的平均ΔCt。
5. 計算 2^-(??Ct)值，即為每個基因的相對表達量
最后在統計分析的時候，直接使用?2^-(??Ct)值進行分析可能不會呈現正態分布且偏態嚴重，這時候可以用log公式進行轉化，再進行后續的統計分析。即：log(?2^-(??Ct))。
