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RNA和DNA中的化學修飾在多種生物過程中發揮著關鍵作用，包括轉錄調控、RNA降解、蛋白質翻譯和免疫調節等。這些修飾已被新的測序方法以單堿基分辨率定量地繪制出來，其中核苷酸脫氨基是一種高效策略，用于選擇性地繪制DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）和RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）。然而，傳統的化學脫氨基方法依賴于在苛刻的酸性條件下使用芳基重氮鹽，這限制了其在大多數生物底物中的應用。近年來，基于亞硝酸鹽離子的RNA測序方法（如NO-seq和NT-seq）雖然簡單且成本效益高，但低轉化效率和苛刻的酸處理可能會導致RNA降解，從而影響檢測的準確性。此外，GLORI方法雖然提高了脫氨基效率和選擇性，但仍受到RNA降解和逆轉錄停止的限制，需要大量的RNA輸入。

為了開發一種溫和的化學脫氨基反應，以克服傳統方法的局限性。近日，芝加哥大學何川團隊通過設計一種接近中性pH值的溫和化學脫氨基反應，不僅可以顯著保護RNA，還能提高信噪比，從而實現對m6A位點的靈敏且穩健繪制。這種方法有望為研究m6A修飾在基因表達調控中的作用提供有力的工具，推動RNA修飾領域的研究進展。相關成果以《Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of?N6-methyladenosine in RNA》為題，發表于Nature子刊《Nature Chemistry》。

標題：Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of?N6-methyladenosine in RNA

發表時間：2025-4-17

發表期刊：Nature Chemistry

影響因子：IF19.2/Q1

單位：芝加哥大學

研究方法

研究者采用一種N-亞硝化策略，通過羰基有機催化劑和路易斯酸催化劑的協同催化作用，實現對RNA中腺苷（A）的脫氨基反應，將其轉化為次黃嘌呤（I）。這種方法被稱為化學協同催化輔助m6A測序（chemical cooperative catalysis-assisted m6A sequencing，CAM-seq）。具體實驗步驟如下：

• 反應條件優化：通過篩選不同的路易斯酸和羰基化合物，研究者發現硼酸和甘油醛（glyoxal）在促進脫氨基反應中表現出最高的效率和選擇性。反應在接近中性的pH值（pH 6.0）下進行，溫度為37℃，時間為12小時。
• 保護基團的選擇：為了避免甘油醛與鳥苷（G）形成加合物導致的逆轉錄酶停止（RT stops），研究者選擇了kethoxal作為保護基團，因為它具有更高的反應速率和更好的可逆性。
• RNA樣本處理：從細胞或植物組織中提取總RNA，并進行poly(A)富集。將提取的RNA片段化，以提高測序效率。
• 測序文庫制備：對化學處理后的RNA進行3'-端修復，連接3'-端接頭，進行逆轉錄反應生成cDNA，再連接cDNA接頭，完成文庫制備。最后對文庫進行PCR擴增，并使用Illumina平臺進行測序。

圖1：羰基有機催化劑和路易斯酸催化的一級胺協同脫氨基反應。

a. 在苛刻的酸性條件下，亞硝酸鹽離子通過逐步的亞硝化和重氮化反應介導脫氨基作用。

b. 本研究和GLORI-seq：由羰基有機催化劑和路易斯酸（LA）催化的協同脫氨基反應。

c. 全轉錄組m6A測序的m6A-CAM-seq方法示意圖。RNA樣本被片段化，并在優化的條件下進行處理，隨后進行純化和測序文庫制備。

研究結果

（1）溫和條件下對底物進行一般脫氨基處理

研究者在溫和條件下對多種核苷酸底物進行了脫氨基反應，發現甘油醛與硼酸三氟化物乙醚（BF3·OEt2）組合能高效脫氨基廣泛的核苷酸底物。通過改變羰基催化劑，從二羰基有機催化劑改為單羰基有機催化劑（如糠醛），可以顯著提高鳥苷類似物的脫氨基產率。研究者推測這可能是因為鳥苷類似物在位置6處可以與甘油醛環化，形成鳥苷-甘油醛加合物。

圖2：由有機催化劑與路易斯酸共同催化的核苷酸脫氨基反應。

a-c. 以胞嘧啶（a）、腺苷（b）和鳥苷（c）及其類似物為底物的脫氨基反應范圍。

d. 在優化的催化條件下，對甲基化核苷進行反應。

（2）闡明反應機制

通過15N核磁共振（NMR）光譜學跟蹤反應過程，研究者發現，在沒有路易斯酸的情況下，15N6腺苷與甘油醛的縮合反應非常緩慢，即使在50℃下加熱2小時后，縮合產物的形成仍然很少。然而，加入BF3·OEt2后，15N標記的腺苷在半小時內迅速轉化為中間體Int 3。二維1H-15N HMBC光譜學被用來監測路易斯酸催化的縮合反應，具有更高的15N靈敏度。在Na15NO2存在的情況下，15N亞胺信號消失，表明其轉化為脂肪族硝基取代的中間體，并隨后重排為N-亞硝化加合物。這些結果證實了通過亞胺中間體的反應路徑。

圖3：反應機制研究與催化循環。

a.15N6腺苷脫氨基反應的一維15N核磁共振（NMR）譜圖。

b. 提出的脫氨基反應的催化循環。

（3）DNA和RNA中腺苷脫氨基的選擇性條件

研究者進一步探索了優化CAM-seq選擇性條件，使其對腺苷的脫氨基反應具有更高的選擇性。通過測試不同的路易斯酸，發現硼酸在提高反應活性方面最為有效。在硼酸存在的情況下，二羰基化合物比單羰基化合物具有更高的脫氨基效率。通過液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析，甘油醛和三氟丙醛都表現出對腺苷的選擇性，但由于三氟丙醛導致的顯著DNA/RNA降解，研究者選擇了甘油醛進行進一步研究。在優化的脫氨基條件下，甘油醛在DNA和RNA中都表現出對腺苷的完全脫氨基反應，而m6A位點保持不變。

圖4：在寡核苷酸中優化脫氨基條件。

a-b.在不同路易斯酸催化劑（a）和羰基有機催化劑（b）條件下，寡核苷酸中腺苷位點的突變比率。硼酸（紅色輪廓）和甘油醛（藍色輪廓）催化劑被選中進行進一步優化（n=4）。

c.不同羰基有機催化劑對A和C脫氨基的催化效率比較。二羰基催化劑在A位點的轉化率高于C位點。

d.在優化條件下，6堿基DNA寡核苷酸CTCAGC表現出對G保護和A脫氨基的高反應性。

e.使用5堿基m6A RNA寡核苷酸探針（ACm6AGU），在與d相似條件下展示A和m6A的選擇性。

f-h. LC–MS/MS監測DNA寡核苷酸脫氨基反應中甘油醛（f）、硼酸（g）和亞硝酸鹽（h）濃度的優化（n=3）。

i-k. LC–MS/MS監測RNA寡核苷酸脫氨基反應中甘油醛（i）、硼酸（j）和亞硝酸鹽（k）濃度的優化（n=3）。

（4）CAM-seq m6A檢測的優化條件

研究者注意到，盡管甘油醛作為一種有機催化劑非常有效，但它傾向于與鳥苷形成加合物，這可能導致逆轉錄酶在逆轉錄過程中停止（RT stops）。因此，研究者選擇了kethoxal作為保護基團，因為它具有更高的反應速率和更好的可逆性。在優化條件下，CAM-seq能夠在接近中性的pH值下進行，顯著減少RNA降解。通過測試11種不同的逆轉錄酶和3種不同的dNTP比例（dTTP/dCTP比例為1:1、1:40和1:400），研究者發現RevertAid RT在dTTP/dCTP比例為1:40時，背景噪聲水平最低，約為0.36%。

圖5：CAM-seq 協議的優化。

a. 使用甘油醛保護的G位點的RNA寡核苷酸探針測試了逆轉錄（RT）停止情況。

b. 使用kethoxal保護的RNA寡核苷酸探針在與a相似的條件下展示了RT停止比率。

c-f. 在中性條件下，使用甘油醛（c,d）和kethoxal（e,f）對DNA寡核苷酸的籠化（caging）（c,e）和去籠化（decaging）（d,f）動態比較。

g. 在中性條件下，甘油醛對kethoxal完全籠化的DNA寡核苷酸的競爭。

h-i. 使用完整的RNA（h）和200個核苷酸片段化的RNA（i）進行RNA降解實驗。

j. 通過插入寡核苷酸測序數據優化逆轉錄酶條件。測試了11種逆轉錄酶和3種dTTP/dCTP比例（1:1、1:40和1:400）。一個突出的條件（RevertAid RT在1:40比例下）顯示出低于0.36%的背景噪聲水平。

（5）人、擬南芥、玉米等不同物種轉錄組中的m6A全面圖譜

使用優化的CAM-seq協議，研究者在人類HEK293T細胞系中鑒定了282281個高度可信的m6A位點（P＜0.001）。其中，235173個和180056個位點的修飾比例分別大于5%和10%。GAC motif最為富集，占HEK293T轉錄組中可信位點的54%，其次是AAC motif，占27%。值得注意的是，YAC（CAC/UAC）和RAU（GAU/AAU）motif，這些與RAC motif僅相差一個核苷酸的motif，也顯示出一定程度的m6A修飾。在人類轉錄組中，m6A富集的motif（如GAC）在3'-UTR區域的終止密碼子附近表現出明顯的富集信號，進一步證實了CAM-seq能夠提供整個轉錄組的高質量m6A圖譜。

研究者還對擬南芥和玉米的RNA樣本進行了分析，發現RAC motif在這些植物中也是最富集的m6A修飾motif。然而，與人類樣本不同的是，RAC motif僅占植物中所有m6A位點的40%，而在人類樣本中約為85%。此外，植物中AAC motif豐度最高，而在人類中則是GAC motif豐度最高。這些結果表明，植物中的m6A修飾模式與人類存在差異，可能與植物中m6A修飾的調控機制有關。

圖6：m6A修飾的精確定量揭示了在motif水平上的m6A沉積。

a. 所有A位點（覆蓋度＞20）的m6A修飾水平分布，以GAC和UAG motif為例。

b. 多種方法檢測到的m6A位點與估計背景噪聲的比較。

c. CAM-seq和GLORI-seq在126362個重疊位點上m6A水平的相關性（r=0.883）。紅色虛線表示相等水平。紅色三角形標記的區域突出了GLORI-seq高估m6A水平的位點。

d. 在三種基于脫氨基的方法中觀察到的所有m6A位點中，AAC motif的比例，計算為所有位點的（m6A比率×覆蓋率）之和與所有位點的（m6A比率×覆蓋率）之和的比值。

e. 人類樣本中所有A位點（無過濾）的平均甲基化水平與相對motif頻率的關系。GAC和AAC motif（紅色）高于背景水平。整體m6A水平表示為0.41%。

f-g. 擬南芥（f）和玉米（g）中所有A位點的平均甲基化水平與相對motif頻率的關系。整體m6A水平分別表示為0.77%和0.69%。

h. 人類、擬南芥和玉米中通過過濾的16 three-letter motif的頻率與平均甲基化水平之間的關系。

i-k. 人（i）、擬南芥（j）和玉米（k）中相對于m6A位點的每個位置核苷酸重要性評分。

（6）飽和分析將轉錄速率與m6A水平關聯分析

研究者通過飽和m6A圖譜分析發現，基因表達水平與平均m6A水平呈負相關。具體來說，高轉錄率基因傾向于具有較低m6A水平，可能是由于m6A沉積復合物的可用性有限，或者甲基轉移酶復合物與轉錄機制在細胞內的動態關聯。此外，研究者還發現，基因的最大m6A修飾水平可以作為區分基因的一個重要參數。將基因分為兩組：一組是所有m6A位點的修飾水平普遍較低的基因，另一組是具有高修飾潛力的基因。這兩組基因的表達水平與m6A水平都呈現出顯著的負相關性。

圖7：影響m6A變化的因子。

a. 插圖展示了A位點的區域和基因分布如何影響基因中m6A修飾水平的變異。

b. 基于meta基因分析，終止密碼子附近的-20到+180核苷酸區域被確定為m6A沉積的熱點區域。

c. 基因間和單個基因內的變異對應數據。

d. log10基因表達水平與平均m6A水平之間的關系，以等高線圖表示，并帶有虛線趨勢線。

e. 所有基因的最大m6A修飾水平分布。低甲基化和高甲基化組的擬合曲線分別用藍色和紅色虛線標記。

f. 基因內平均m6A修飾水平與最大m6A修飾水平之間的相關性。

g-h. 僅低修飾基因（g）和僅高修飾基因（h）的log10基因表達水平與平均m6A水平之間的關系。

i. 所有基因（黑色）、無m6A修飾基因（藍色）、低m6A修飾基因（黃色）和高m6A修飾基因（紅色）的m6A水平與基因表達之間的總體關系。

CAM-seq、NO-seq、NT-seq、GLORI、MeRIP-seq等m6A測序方法介紹及比較

（1）CAM-seq（化學協同催化輔助的m6A測序）

原理：通過化學協同催化策略，利用羰基催化劑和路易斯酸催化劑的協同作用，將RNA中的腺苷（A）轉化為次黃嘌呤（I），而m6A位點抵抗脫氨基反應，保持為腺苷。通過逆轉錄酶或DNA聚合酶讀取時，I被讀作鳥嘌呤（G），從而實現m6A檢測。

優點：

溫和條件：反應在接近中性的pH值下進行，避免了RNA降解。

低背景噪聲：背景噪聲低至0.5%，遠低于其他方法。

低輸入量：僅需10ng的RNA輸入即可實現高分辨率檢測。

高靈敏度：能夠檢測到低比例的m6A修飾位點。

應用場景：

適用于低輸入量的RNA樣本，如單細胞RNA測序、微量組織樣本等。

（2）NO-seq（硝酸鹽介導的m6A測序）

原理：通過硝酸鹽離子介導的化學脫氨基反應，將RNA中的腺苷（A）轉化為次黃嘌呤（I），從而實現m6A的檢測。

優點：

操作簡單：不需要復雜的酶反應步驟。

成本低：試劑成本較低。

缺點：

反應條件苛刻：需要在酸性條件下進行，可能導致RNA降解。

背景噪聲高：由于反應不完全，背景噪聲較高，影響檢測準確性。

（3）NT-seq（硝酸鹽介導的轉錄組測序）

原理：與NO-seq類似，通過硝酸鹽離子介導的化學脫氨基反應，將RNA中的腺苷（A）轉化為次黃嘌呤（I），從而實現m6A的檢測。

優點：

操作簡單：不需要復雜的酶反應步驟。

成本低：試劑成本較低。

缺點：

反應條件苛刻：需要在酸性條件下進行，可能導致RNA降解。

背景噪聲高：由于反應不完全，背景噪聲較高，影響檢測準確性。

（4）GLORI（化學保護基團介導的m6A測序）

原理：通過化學保護基團（如甘油醛）保護鳥苷（G），然后進行化學脫氨基反應，將RNA中的腺苷（A）轉化為次黃嘌呤（I），從而實現m6A的檢測。

優點：

選擇性高：通過保護基團的選擇性保護，提高了脫氨基反應的選擇性。

高靈敏度：能夠檢測到低比例的m6A修飾位點。

缺點：

反應條件苛刻：需要在酸性條件下進行，可能導致RNA降解。

背景噪聲高：由于保護基團的不完全去除，可能導致背景噪聲較高。

高輸入量：需要較多的RNA輸入量（通常為微克級別）。

（5）MeRIP-seq（m6A免疫沉淀測序）

原理：通過特異性的m6A抗體對RNA進行免疫沉淀，然后通過高通量測序檢測m6A修飾位點。

優點：

全轉錄組：能夠實現全轉錄組的m6A檢測。

廣泛適用：適用于多種類型的RNA樣本。

缺點：

高輸入量：需要較多的RNA輸入量（通常為微克級別）。

背景噪聲高：由于抗體的非特異性結合，可能導致背景噪聲較高。

操作復雜：需要進行免疫沉淀步驟，操作較為復雜。

#基礎技術方法論專題 #m6A專題

關于易基因RNA m6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術

易基因MeRIP-seq技術利用m6A特異性抗體富集發生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結合高通量測序，可以對RNA上的m6A修飾進行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應用于組織發育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥發生與發展、藥物應答等研究領域；可應用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測。

大樣本量m6A-QTL性狀關聯分析，傳統MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔。易基因開發建立MeRIP-seq2技術，顯著提成IP平行性，實現不同樣本間相對定量，降低檢測成本。

易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術：

• m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測序（MeRIP-seq）
• m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測序（lnc-MeRIP-seq）
• m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
• 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測序（MeRIP-seq2）

技術優勢：

• 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
• 轉錄組范圍內：可以同時檢測mRNA和lncRNA；
• 樣本要求：可用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測；
• 重復性高：IP富集重復性高，最大化降低抗體富集偏差；
• 應用范圍廣：廣泛應用于組織發育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥的發生與發展、藥物應答等研究領域。

研究方向：

m6A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究

• 疾病發生發展：腫瘤、代謝疾病（如肥胖/糖尿病）、神經和精神疾病（如阿爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
• 發育和分化：早期胚胎發育、個體/組織/器官生長發育、干細胞分化與命運決定、衰老
• 環境暴露與響應：污染、抗逆、生活方式

關于m6A甲基化研究思路

（1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數量變化、m6A修飾基因數量變化、單個基因m6A peak數量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析

（2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時序數據的分析策略、時序數據的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示

（3）m6A甲基化組學&轉錄組學關聯分析：Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、m6A修飾目標基因的篩選策略

（4）進一步驗證或后期試驗

易基因提供全面的表觀基因組學（DNA甲基化、DNA羥甲基化、cfDNA）和表觀轉錄組學（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA與蛋白互作）、DNA與蛋白互作及染色質開放性技術方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻：

Wang, P., Ye, C., Zhao, M. et al. Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA. Nat. Chem. (2025).?https://doi.org/10.1038/s41557-025-01801-3

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