一、寫在前面

今天分享的是發表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上題目為"Technological advances in cancer immunity: from immunogenomics to single-cell analysis and artificial intelligence"的文章。

? IF：40.8

DOI:10.1038/s41392-021-00729-7

二、內容概要

免疫療法在癌癥治療中起著關鍵作用。然而，只有少數患者對免疫檢查點阻斷和其他免疫治療策略有反應，因此需要更多新技術來破譯腫瘤細胞與腫瘤免疫微環境?（TIME）?成分之間復雜的相互作用。下一代測序的快速發展，使高通量基因組和轉錄組數據可用于計算免疫細胞的豐度和預測腫瘤抗原，稱為腫瘤免疫組學，單細胞測序技術能夠通過精確的免疫細胞亞群和空間結構研究更好地解剖?TIME，其次放射組學和基于數字病理學的深度學習模型等人工智能技術對預測免疫治療的反應方面具有深遠的意義。

三、研究背景

腫瘤細胞與附近的正常細胞存在復雜的細胞交流，影響著腫瘤細胞的生長與行為，這些細胞中，免疫細胞是主要參與者，其既促進又抑制癌變、腫瘤進展、轉移和復發。這篇綜述中，作者主要關注了TIME，探究如何將免疫細胞的促腫瘤作用轉變為抗腫瘤作用。

? ? ? 新一代測序技術的發展極大地推動了免疫基因組學的進展，單細胞測序和人工智能迎來了腫瘤免疫的新紀元，作者在這篇文章中主要探究了免疫組學在腫瘤中的技術進展和臨床意義。

四、主要內容

1.TIME簡介

近年來，人類對腫瘤的認識發生了巨大變化。腫瘤的定義也從單純的腫瘤細胞聚集，轉變為一個復雜的類似器官結構，由腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞以及其他間質細胞等組成。TIME的研究熱點包括包含免疫浸潤、血管、細胞外基質等所有結構的腫瘤周圍區域，即腫瘤微環境（TME），腫瘤免疫學的發展，證實了TIME對腫瘤的發生、進展、轉移、復發以及潛在治療靶點起著決定性作用。

TIME主要由免疫細胞和分泌因子（如細胞因子、趨化因子和生長因子）兩大類組成。免疫細胞方面，TIME包含極其多樣化的免疫細胞亞群，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（DCs）、粒細胞和髓系來源的抑制細胞（MDSCs）等。通常情況下，T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞有助于抑制腫瘤生長，而MDSCs和調節性T細胞（Tregs）則傾向于抑制抗腫瘤免疫。但已有研究表明，由于與腫瘤細胞的復雜相互作用，免疫細胞的具體作用可能會動態改變，甚至完全相反。例如，CD8+?T細胞的抗腫瘤功能可能因T細胞耗竭而被抑制，而在低糖酵解腫瘤中，CTLA-4阻斷后，Treg細胞功能向干擾素-γ產生細胞的不穩定轉變可能會促進抗腫瘤免疫。總之，眾多免疫細胞類型以及特定免疫細胞類型的不同功能狀態，可能對腫瘤免疫產生相反的影響（Fig.1）。

Fig.1

2.NGS?時代的免疫組學技術——免疫基因組學。

過去二十年里，包括全基因組測序（WGS）、全外顯子組測序（WES）和RNA測序（RNA-seq）在內的下一代測序（NGS）技術已成功開發并應用于獲取人類全基因組信息。

在NGS時代，免疫基因組學的研究可通過異常肽預測、人類白細胞抗原（HLA）分型和主要組織相容性復合物（MHC）-肽結合親和力預測來識別免疫原性蛋白。例如，有研究基于DeepMHCII算法，通過引入位置編碼來進一步提高MHC-II親和肽預測任務中深度學習模型的性能。

3.定量TIME中的免疫細胞。

TIME由各種免疫細胞組成，流式細胞術和免疫組織化學等傳統技術對于大規模的分析是不切實際的，成本高且組織可用性低，因此研究者們考慮使用計算機模擬分析，利用不同細胞類型的基因表達譜差異來代表免疫細胞類型，計算方法的基本原理主要分為基因富集分析（GSEA）和反卷積（Table.1-2）。

Table.1-2

基于GSEA分析的算法主要包括ESTIMATE，?xCell和MCP-counter。STIMATE算法通過單樣本基因集富集分析（ssGSEA）提供免疫得分和基質得分，以代表免疫細胞和基質細胞的比例和分布，可以區分腫瘤和基質成分，但不能區分具體的免疫細胞類型；xCell是另一種基于ssGSEA的方法，從多個RNA-seq和微陣列數據源中獲取基因集，以表征不同的細胞類型，增加魯棒性，避免噪聲干擾。與ESTIMATE相比，xCell使用溢出補償校正，更好地區分關系密切且高度相似的細胞類型；MCP-counter基于標記基因表達水平的幾何平均值，為每個TIME細胞群體（包括免疫細胞、內皮細胞和成纖維細胞）生成豐度得分。

基于反卷積的算法主要包括?CIBERSORT，quanTIseq，FARDEEP和MuSiC。CIBERSORT利用線性支持向量回歸和基因表達矩陣來表征免疫浸潤成分。quanTIseq專門用于分析RNA-seq數據，分析流程包括原始RNA-seq數據預處理、基因表達量量化和基于約束最小二乘回歸的反卷積。該方法還整合了蘇木精-伊紅（H&E）、IHC和免疫熒光（IF）染色切片的圖像信息，以補充基因表達反卷積，實現免疫細胞絕對比例和獨特免疫細胞密度的免疫分析。FARDEEP關注基因表達中的異常值對反卷積準確性的影響，利用最小截尾平方（LTS）構建適用于重尾噪聲數據集的穩健模型。MuSiC考慮跨個體和跨細胞的一致性，利用scRNA-seq生成細胞類型特異性的基因集，用于批量RNA-seq數據的反卷積分析。以上免疫基因組學技術廣泛用于描述特定癌癥類型的整體免疫浸潤。

4.鑒定腫瘤抗原

基因組水平的突變、轉錄組水平的突變和蛋白質組水平的改變可以導致異常蛋白質的表達，即腫瘤抗原。這些抗原可以被免疫細胞識別并觸發抗腫瘤免疫反應。免疫基因組學技術通過計算機模擬分析來預測異常肽段、進行HLA分型和預測MHC-肽結合親和力，這對于識別腫瘤抗原非常有幫助和必要。主要包括從WES、WGS或RNA-seq數據中預測異常肽段；進行HLA分型和預測MHC與肽段的結合親和力，以確定哪些肽段能夠被T細胞識別。

新抗原疫苗已成為腫瘤疫苗的主要發展方向。近年來，多項臨床試驗評估了新抗原疫苗的效果，顯示出改善患者生存的潛力。隨著測序技術和生物信息學算法的發展，研究人員能夠從測序數據中提取最大信息，將遺傳異常與抗腫瘤免疫相關聯，預測腫瘤抗原，從而設計腫瘤疫苗。

5.單細胞時代的免疫組學

盡管使用NGS技術研究腫瘤免疫學取得了巨大進展，但批量測序的缺陷逐漸顯現。批量測序使用從組織或大量細胞群體中提取的RNA（或DNA），可能導致信號稀釋低于檢測下限，并平均化個體細胞表達模式，掩蓋單個細胞的反應。除了腫瘤內異質性（ITH）和免疫細胞的顯著多樣性外，許多重要的生物學現象可能被批量測序在腫瘤免疫探索中掩蓋。在這里，作者比較了一些單細胞水平免疫組學技術（Table.3）。

Table.3

基于蛋白質的單細胞分析

為進行單細胞研究，在流式細胞儀發展的基礎上，研究者們開發了飛行時間流式細胞術?CyTOF，使用金屬同位素而不是熒光團標記抗體，然后使用飛行時間檢測器對信號進行定量，該檢測器可檢測至少?40?個參數，避免了光譜重疊的問題。光譜流式細胞術是促進傳統流式細胞術有效性的另一項最新技術進步。與質譜流式細胞術不同，光譜流式細胞術仍然使用熒光染料標記抗體，但用色散光學元件和測量全發射光譜的新型檢測器取代了經典的光學元件和檢測器。在實際應用過程中，因費用、處理速度和可操作性的問題，限制了流式細胞術的應用和發展。

而單細胞技術的突破徹底改變了對腫瘤免疫的理解，除了TIME中的免疫細胞和腫瘤細胞，所有TIME中的細胞都高度異質，并具有獨特的基因表達譜和膜蛋白表達，同時，單細胞分析技術的發展為癌癥的診斷、監測和治療提供了新的工具。通過分析或評估B細胞受體（BCRs）或T細胞受體（TCRs）的庫，可以促進診斷和監測工具以及有效免疫療法的開發。這些技術的發展有助于更好地理解癌癥免疫學的機制，從而提高對癌癥的診斷和治療效果。

基于?NGS，單細胞測序可分為以下兩個主要步驟：單細胞分離和單細胞分析，整個工作流程包括以下五個基本步驟：單細胞樣品制備、全基因組或轉錄組擴增、文庫制備、測序和數據分析。如何分離單個細胞并保持其生物活性，如何解決擴增引入的巨大技術噪音并提高靈敏度，如何以最低的價格獲得最高數量的可測量基因，以及如何更高效地分析數據大大提高了單細胞測序的門檻并限制其廣泛使用。

用于研究空間結構的單細胞分析

研究發現，不僅僅?TIME?的組成部分，而且空間結構也顯著影響抗腫瘤免疫，TIME空間結構方法的發展主要分為以下四個階段，初始或新興階段、成長階段、成熟階段和后成熟階段（Fig.2）。在初始階段，對H&E染色的腫瘤樣本載玻片的組織成分進行顯微鏡分析，從而提供空間結構的圖像。在成長階段，免疫標記的發展顯著改進了TIME空間結構方法。免疫組織化學（IHC）和免疫熒光（IF）利用針對特定細胞中某些抗原的熒光染料或酶報告標記抗體來更精確地區分細胞類型，但與流式細胞術類似，mIHC/IF會受到光譜重疊的限制。進入成熟階段，編碼檢測（CODEX）是一種多重細胞成像方法，用設計的特定條形碼（包含獨特的寡核苷酸序列）代替熒光染料或酶報告物。熒光dNTP類似物和原位聚合物基索引程序有助于提供切片的圖像。

在后成熟階段，空間轉錄組學技術如GeoMx（來自Nanostring）使用一種靶向FISH檢測方法，通過光切割和DNA探針測序，可以在組織的一個選擇的微觀區域檢測多達10,000個基因。這些DNA探針與目標基因雜交，探針面板現在接近全轉錄組覆蓋水平。同時，DBiT-seq微流控方法，允許以空間分辨的方式將DNA條形碼傳遞到組織切片中，并創建10-50 μm空間條形碼像素，也被報道，Seurat?是一種空間映射技術，使用一系列復雜的模型來推斷單個細胞的原始空間位置。R包 （Seurat v3） 可以準確定位細胞亞群。

在單細胞時代，免疫組學技術的發展使研究人員能夠更全面地理解腫瘤免疫微環境中的細胞異質性和空間結構。從H&E染色到mIHC/IF，再到空間轉錄組學等成熟技術，每一步都顯著提高了我們對TIME空間結構的理解。

Fig.2

6.免疫組學和人工智能。

隨著計算機技術的發展，人工智能（AI），模仿人類認知功能，如學習和決策——已廣泛應用于各個領域。在醫學領域，科學家關注機器學習甚至更先進的深度學習在疾病診斷、預后和治療反應預測中的應用。在腫瘤免疫研究中，AI協助臨床醫生更好地分析與TIME和免疫治療反應相關的腫瘤免疫特征。AI在癌癥免疫研究中的技術進步主要涉及以下方面：（1）減輕病理切片需要手動識別免疫浸潤的工作量；（2）提供一種替代技術，識別肉眼難以區分的免疫細胞亞群和空間結構；（3）提供一種非侵入性方法，預測TIME和免疫治療反應的特定患者特征。AI在癌癥免疫研究中的主要理論是利用高維特征或操作程序深入挖掘患者腫瘤內免疫浸潤的特征。

使用深度學習方法預測腫瘤抗原

解碼腫瘤抗原的第一步是預測異常肽段。除了已開發的多種識別單核苷酸變異（SNVs）的算法外，最近設計的CN-learn工具用于檢測拷貝數變異（CNVs），表現出良好的性能。在HLA分型方面，Bulik等人生成了一個大型綜合數據集，包括各種癌癥組織和已發布數據中的HLA類型和HLA肽段，可用于訓練全質譜深度學習模型EDGE，最近引入的兩種有前景的計算深度學習方法MARIA和MixMHC2pred，大大提高了MHC-II預測的準確性。這兩種深度學習方法的性能超過了之前流行的工具NetMHCIIpan，這兩種程序預測的新抗原已被證明可以刺激反應性的CD4+ T細胞。

隨著AI在醫學影像學中的發展，影像已不再僅僅是圖片，而是大規模的數字數據。從感興趣區域（ROIs，通常包含腫瘤部位）提取的定量和定性特征可以表征腫瘤的生物學行為，并與臨床結果相關聯。這一利用AI技術分析影像數據的過程稱為放射組學（radiomics）。放射組學技術在腫瘤免疫中的應用主要用于識別反映免疫浸潤的生物標志物，并預測接受免疫檢查點阻斷（ICB）治療患者的治療反應（Fig.3）。

Fig.3

隨著技術的進一步發展，放射組學和數字病理學有望在癌癥免疫治療中發揮更大的作用。這些技術不僅能夠提供更詳細的免疫信息，還能通過非侵入性方法預測患者的治療反應和臨床結果。未來的研究將集中在標準化放射組學研究和探索其生物學意義，以提高這些技術在臨床實踐中的應用價值。

7.免疫組學在腫瘤免疫治療中的應用。

癌癥免疫治療主要分為以下六大類：溶瘤病毒、細胞因子治療、抗體治療、免疫檢查點阻斷、CAR-T和癌癥疫苗。免疫療法一直是除手術、化療和放療之外，在多種類型癌癥中最重要的治療方法之一。然而，大量患者對免疫治療的反應較低，因此必須事先確定患者的生物標志物，其次驗證靶點是否有效。

通過生物信息學算法和單細胞技術，研究人員可以識別ICBs的前景生物標志物。利用轉錄組數據，研究人員可以枚舉腫瘤免疫微環境（TIME）中的免疫細胞組成，并使用GSEA基礎或細胞解卷積基礎算法（如ESTIMATE、CIBERSORT和MCP-counter）估計腫瘤純度。此外，IMC、CODEX和MIBI-TOF等有前景的技術不僅提供了具有治療意義的細胞群體，還提供了不同免疫細胞和腫瘤細胞的相對空間分布，這些是潛在的靶點或生物標志物。放射組學技術也能夠預測多種癌癥類型中患者的免疫浸潤狀態和對免疫治療的反應（Table.4）。

Table.4

識別ICB的生物標志物以進行患者分層

盡管?ICB?無疑是腫瘤治療的里程碑，但只有一部分患者從中受益。因此，需要治療性生物標志物將患者分為對?ICB?敏感和非敏感，并指導精準醫療。作為ICB的靶點，通過IHC檢測的PD-L1表達水平是第一個被發現的預測生物標志物，但幾項臨床試驗揭示了ICB在高PD-L1表達患者中的中等療效。

預測CAR-T治療的新抗原

CAR-T是一種免疫治療方法，其將轉基因或擴增的自體或同種異體?T?細胞再輸注到患者體內以增強抗腫瘤免疫力。免疫基因組學主要在CAR-T治療中鑒定理想的腫瘤抗原。具體來說，一旦獲得患者?NGS?數據，就可以進入?CAR-T靶向腫瘤抗原預測，包括異常肽預測、HLA?分型、抗原-MHC?結合親和力和新抗原優先級等。

為個性化癌癥疫苗選擇新抗原

免疫基因組學方法已廣泛應用于臨床研究中的疫苗開發。一般來說，用于生成個性化疫苗的新抗原是通過分析腫瘤和正常組織的?WES?和?RNA-seq?并通過?NetMHCpan?等算法預測有效表位來鑒定的，腫瘤疫苗開發的關鍵參數是理想的新抗原鑒定。

五、總結討論

文章綜述了腫瘤免疫學領域的傳統及前沿技術，并探討了其臨床應用前景，旨在為研究人員提供參考。在批量測序時代，CIBERSORT和MCP - counter等計算算法可用于評估腫瘤免疫細胞，幫助更好地探索腫瘤免疫細胞的個體浸潤模式。

該技術涵蓋異常肽段預測、HLA分型以及腫瘤抗原?- MHC結合親和力預測等方面，在臨床前和臨床研究中均顯示出可靠的效力，個性化腫瘤疫苗和CAR-T是其應用的代表。

鑒于免疫細胞亞型的高度多樣性和腫瘤內異質性（ITH），從流式細胞術、光譜流式細胞術到CyTOF等單細胞免疫相關技術的發展，使得單細胞腫瘤免疫圖譜能夠協助進行免疫細胞亞群分類，以解析腫瘤免疫微環境（TIME）的組成。

通過H&E染色、IHC/IF、MIBI - TOF或空間分辨轉錄組學等方法，可對TIME進行高分辨率可視化，其中空間分辨轉錄組學是2020年的標志性方法。

AI的出現為免疫組學的發展提供了新方向。放射學和病理學圖像衍生的組學數據能夠對TIME進行特征描述，以預測預后和對免疫治療的反應，顯示出非侵入性或微創方法在臨床應用中的潛力（Fig.4）。

Fig.4