一、技術背景

單細胞RNA測序（scRNA-seq）自問世以來，極大推動了細胞異質性和組織復雜性的研究。但RNA水平并不能完全代表蛋白質水平，因為蛋白質的表達受轉錄后調控、翻譯效率及蛋白降解等多種因素影響。此外，許多細胞類型的特征依賴于表面蛋白的表達，單純靠轉錄組數據難以準確區分。
CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing) 技術在 2017 年由 Stoeckius 等人提出，利用抗體標簽的DNA條形碼標記細胞表面蛋白，并與RNA一起測序，實現了細胞轉錄組與蛋白質表面表型的聯合分析。

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二、技術原理

• 抗體-寡核苷酸偶聯物（Antibody-Oligo Conjugates）
  研究人員將單克隆抗體與獨特的DNA寡核苷酸條碼（ADT，Antibody Derived Tags）偶聯，每個抗體對應特定的條碼，針對不同表面蛋白。

• 雙重標記單細胞
  在細胞懸液中，使用這些抗體混合物與細胞表面靶點結合，完成細胞表面蛋白的特異性標記。

• 單細胞捕獲與裂解
  標記完成后，利用微流控芯片或油滴包裹技術捕獲單個細胞，細胞裂解后釋放的RNA和抗體攜帶的DNA條碼共同進行反轉錄。

• 文庫制備及高通量測序
  RNA和ADT條碼分別構建測序文庫，進行下一代測序（NGS）。

  • RNA測序獲得基因表達譜

  • ADT測序獲得蛋白表達量信息

• 數據整合分析
  通過生物信息學方法，將RNA和蛋白質數據結合，得到每個細胞的轉錄組和表面蛋白雙模態信息。

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三、實驗流程

1. 抗體標記
   細胞懸液與含有獨特DNA條碼的抗體混合，進行細胞表面蛋白標記。

2. 單細胞捕獲
   使用10x Genomics等平臺，將標記細胞單獨封裝于微滴中。

3. 細胞裂解及逆轉錄
   裂解細胞釋放mRNA和ADT條碼，逆轉錄成cDNA。

4. 文庫構建
   分離RNA和ADT條碼，分別進行擴增和文庫制備。

5. 高通量測序
   使用Illumina測序平臺測序。

6. 數據處理

   • RNA數據進行標準scRNA-seq分析（質控、歸一化、降維、聚類）

   • ADT數據進行計數和歸一化，獲得蛋白表達強度

   • 融合兩組數據，實現多模態分析

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四、技術優勢

• 多模態信息獲取：同時得到轉錄組和蛋白質信息，全面反映細胞功能狀態。

• 細胞類型鑒定準確：結合蛋白表達信息可以更準確地區分亞群和狀態。

• 低樣本需求：和傳統流式細胞術相比，對樣本量需求更低。

• 兼容現有scRNA-seq平臺：可直接在10x Genomics等主流單細胞平臺上實施。

• 適合復雜樣本分析：腫瘤、免疫微環境、干細胞分化等多領域均可應用。

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五、數據分析特點

• 雙模態數據處理：需要針對 RNA 和 ADT 數據分別預處理，常用歸一化方法有所不同。

• 多組學融合：主流分析軟件如 Seurat、Scanpy 已支持 CITE-seq 數據的聯合降維和聚類。

• 去除背景噪聲：ADT數據可能存在非特異性結合或背景信號，需要特定算法校正。

• 細胞類型注釋：結合蛋白和基因標記更精準，特別是在免疫細胞類型劃分中優勢明顯。

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六、主要應用領域

• 免疫細胞研究
  精準劃分免疫細胞亞型，分析免疫應答和免疫治療機制。

• 腫瘤微環境分析
  同時捕獲腫瘤細胞與免疫細胞的轉錄組和蛋白質信息，解析細胞互作。

• 干細胞與發育生物學
  追蹤細胞分化路徑，揭示細胞命運決定機制。

• 疾病機制探索
  解析復雜疾病中細胞的多層次狀態和功能變化。