前情回顧

上次小編為大家講解了四種以基因組為基礎的多組學聯合研究方案（基因組與轉錄組，深入挖掘基因表達信息；基因組聯合代謝組與轉錄組，鎖定關鍵通路；基因組與群體進化，解析物種發展歷程；基因組結合GWAS與進化，探索重組遺傳效應 ） 并通過八篇高分合作文章作為經典案例進行案例概述。詳情可點擊→基因組學深入挖掘·研究方案（上篇）進行回看。
相信很多老師根據上期方案概述已經有了適合自己的研究思路或是找到了自己研究中的影子，但是基因組作為一種基礎且必要的研究，其身上的挖掘方向遠遠不止這些~接下來我們將精彩繼續，咱們接著談談關于基因組學研究的其他幾種熱點方案~

方案五

基因組與遺傳圖譜，連鎖分析定位性狀

技術介紹

遺傳圖譜是目前最經典的功能基因定位策略，主要基于高通量測序技術開發單核苷酸多態性位點（SNP），并計算多態性標記間的遺傳連鎖距離，構建高密度遺傳圖譜，最后結合性狀調查對目標區域進行定位。數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）是指基因組中引起數量性狀變異的座位。作物的產量、質量、株型、生長發育等大多數重要經濟性狀及農藝性狀通常都為數量性狀。利用分子標記，通過連鎖分析進行QTL定位，是遺傳學中研究數量性狀相關功能基因的基本手段和確定分離并分離目標基因的前提。而優質的基因組才能為性狀精準定位提供有力支持。

技術路線

適用范圍

雙親雜交得到的性狀分離群體

包括暫時性分離群體，如F1、F2、F3、BC等

永久性分離群體，如DH、RIL等

產量、育性、花期、果實性狀、抗病蟲、抗鹽堿、抗寒、品質、株型、性別決定、代謝物等性狀定位

高分案例

植物案例一

英文名：The Coix genome provides insights into Panicoideae evolution and papery hull domestication[1]

中文名：薏苡基因組為黍亞科進化及薄皮作物馴化提供新見解

期刊：Molecular Plant（IF：12.084）

合作單位：四川農業大學

主要研究內容：
作者以飼用薏苡 “大黑山”為研究對象，利用PacBio組裝了1.62 Gb的薏苡基因組，contig N50達到了2.24 Mb，并通過Hi-C將1.5 Gb的序列定位到10條染色體上。比較基因組分析揭示了薏苡高生物量和生物抗性的可能原因。作者通過對兩種不同種殼品種進行轉錄組差異基因聚類分析，揭示薏苡種殼薄皮形成原因，解析馴化選擇機制。最后將兩種不同種殼品種雜交產生的F2群體構建遺傳圖譜，對種殼抗壓性、抽穗期、株高和分蘗數等性狀QTL定位。后期擴大群體精細定位，進一步將這2個QTLs分別定位到250Kb和140Kb的區間內。該研究有助于推動薏苡關鍵藥用成分的研究和傳統中藥的現代化應用，為薏苡糧、藥、飼專用新品種的高效選育奠定了堅實的基礎。

植物案例二

英文名：Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[2]

中文名：群體基因組分析結合從頭組裝揭示雜草稻作為進化演繹的起源

期刊：Molecular Plant（IF：12.084）

合作單位：沈陽農業大學

主要研究內容：

作者使用WRAH和 Qishanzhan 栽培稻的雜交，獲得包含 168 個子代的 RIL 群體，利用 SLAF-seq 技術進行測序，構建高密度遺傳圖譜。對種子落粒、長芒、高株高、色殼和紅果皮5個性狀進行定位。并對不同地域品種的333份水稻構建系統發育樹，明確WRAH的分群情況，并通過選擇性清除分析發現馴化相關基因可能在平行進化中發揮重要作用。基于以上研究作者通過PacBio+Hi-C組裝了高質量的亞洲高緯度雜草稻WR04-6基因組，并通過比較基因組分析研究相關基因家族及分化時間。該研究揭示了栽培稻在從野生稻馴化后，近代的遺傳改良成為了亞洲高緯度雜草稻與粳型栽培稻遺傳趨異的分水嶺。

方案六

基因組與表觀遺傳，解析三維網絡調控機制

技術介紹

表觀遺傳（epigentics） “epi”表示“其上”或“超越”，genetics只設計基因的結構層次，而epigenetics則涉及基因如何發揮其功能以及基因間的互作關系。基因組結合表觀調控可更加深入的剖析物種在何時、何地、以何種方式去應用遺傳信息的指令。多種表觀遺傳研究手段間可相互組合，從三維基因、修飾表達、調控元件等多種層面解析不同調控原理。

技術路線

適用范圍

不同物種間調控因子差異研究

脅迫等差異環境響應調控機理

發育生長、病理恢復間基因結構/調控機制

不同組織，器官轉錄活性差異，找到組織特異基因和啟動子

非生物逆境，病蟲害，營養，激素等處理前后及動物疾病差異

宏觀分析細胞在該特定時空下整個基因組的調控網絡

高分案例

植物案例

英文名：N6-Methyladenine DNA Methylation in Japonica and Indica Rice Genomes and Its Association with Gene Expression, Plant Development and Stress Responsesence[3] 中文名：粳稻和秈稻基因組N6-甲基腺嘌呤DNA甲基化及其與基因表達、植物生長和應激反應的關系
期刊：Molecular Plant（IF：12.084）
合作單位：中國農業科學院生物技術研究所

主要研究內容：
作者利用PacBio對粳稻日本晴栽培種Japonica Nipponbare (Nip)及秈稻栽培種Indica 93-11進行測序。最終組裝Nip基因組大小為380.7 Mb（contig N50=16.97 Mb），93-11基因組大小為396 Mb（contig N50=9.64 Mb）。新組裝的Nip和93-11基因組的contigN50分別比先前公布的高2.2倍和460倍。并使用改進的水稻（Nip、93-11）基因組和SMRT測序鑒定了粳稻和秈稻基因組中全基因組的6mA位點的單核苷酸分辨率。并報道了93-11中第一個6mA甲基位點，發現Nip和93-11中6mA位點在著絲粒周圍異染色質區域附近富集；6mA與水稻中的活性表達基因有關；Nip、93-11和擬南芥中6mA的分布及其與轉錄的關系是保守的。6mA與熱應激關鍵基因的表達呈正相關。篩選了與表觀遺傳學相關的潛在突變體，并發現DDM1對水稻中的6mA修飾是必不可少的。

方案七
種內/種間基因組變異，掌控起源及功能關系

技術介紹

對于大部分動植物，其測序主要基于單一品種作為參考基因組。單一基因組測序通常只能覆蓋基因組的80%~90%，且通常只有代表馴化的優良品種的單一基因型能夠被準確檢測到，因此不同生態型重測序數據一般只有50%~80%能比對到參考基因組上。而通過對兩種品系基因組進行denovo（或者與已發表品系進行研究），充分比較其間的基因組變異信息，可以更好的對不同生態型進行表型功能差異分析。結合兩種生態型品種雜交子代圖譜，將極大的利于后續性狀與功能研究。與動物相比植物更具有品種多樣性，因此該研究方案目前更多的應用于植物材料中。
而親緣關系較近的種間材料同樣可以分別進行denovo，并通過其間的變異分析掌控物種間的起源進化及功能關系。

技術路線

適用范圍

品種材料間優秀性狀檢測與育種

物種間基因組進化關系

大型結構變異與性狀分析

高分案例
植物案例一（種間變異）

英文名：Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[4] 中文名：異源四倍體陸地棉和海島棉基因組破譯
期刊：Nature Genetics（IF：27.603）
合作單位：華中農業大學

主要研究內容：

作者利用三代測序(PacBio)+光學圖譜+Hi-C相結合的方法進行異源四倍體陸地棉和海島棉基因組組裝。組裝獲得陸地棉Contig L50 = 1.89 Mb，海島棉Contig L50 = 2.15 Mb，Hi-C染色體掛載效率分別為 98.94%和97.68%。對異源四倍體陸地棉和海島棉進行全基因組變異分析，包括SNPs和Indels變異分析，染色體結構變異及PAVs分析。將A-亞基因組供體二倍體祖先種亞洲棉G. arboreum與陸地棉和海島棉進行比較，證明了從二倍體到四倍體多倍化過程中發生了結構變異。通過構建滲入系，將海島棉的有利染色體片段導入到陸地棉中，并進行QTL定位，在兩種代表性種質間探索研究了具有潛在優質纖維質量性狀的基因組序列信息，從而幫助棉花改良育種。

植物案例二（種內變異）

英文名：Extensive intraspecific gene order and gene structural variations in upland cotton cultivars[5] 中文名：陸地棉栽培種廣泛的基因順序和基因結構變異
期刊：Nature Communications（IF:12.121）
合作單位：中國農業科學院棉花研究所

主要研究內容：

作者利用三代PacBio測序，對陸地棉（G. hirsutum）遺傳研究標準種TM-1和易于轉化的生物技術重要品種ZM24 進行測序，組裝TM-1基因組2.286 Gb (Contig N50=4.760 Mb)， ZM24基因組2.309 Gb(Contig N50=1.976 Mb)，利用Hi-C將TM-1組裝到染色體水平（掛載率97.4%）。通過二者的基因組與二倍體祖先種之間的比較，發現了大量的遺傳變異。TM-1 與 ZM24 比較發現有大量倒位、染色體內易位和染色體間易位，3個最大的結構變異來自于A08 染色體，PAV 基因可能在多倍體的形成過程中已經出現。進一步通過兩個栽培種和種質panel的作圖群體的單倍型分析顯示該區域的重組率受到抑制。本研究為棉花研究領域提供了更多的基因組資源，鑒定的遺傳變異，將對未來的棉花育種具有幫助。

方案八

泛基因組，解析物種表型及性狀多樣性

技術介紹

泛基因組(Pan-genome)即某一物種全部基因的總稱，包括核心基因（core gene；由所有個體都存在的基因組成）和非核心基因（dispensable gene；僅在單個個體或部分個體中存在的基因組成）。泛基因組分析有助于理解物種的特征，同時泛基因組圖譜提供的基因PAV變異或基因復制等復雜基因組變異，有助于解析作物表型和農藝性狀的多樣性。選擇不同亞種材料進行泛基因組測序，可以研究物種的起源及演化等重要生物學問題；選擇野生種和栽培種等不同特性的種質資源進行泛基因組測序，可以發掘重要性狀相關的基因資源，為科學育種提供指導；選擇不同生態地理類型的種質資源進行泛基因組測序，可以開展物種的適應性進化、外來物種入侵性等熱門科學問題。

技術路線

適用范圍

多表型作物性狀功能研究

功能基因育種基礎

多樣品種來源傳播探索

重要性狀基因資源發掘

外來物種入侵考究

高分案例
植物案例一

英文名：The barley pan-genome reveals the hidden legacy of mutation breeding[6] 中文名：大麥泛基因組揭示了突變育種的潛在遺傳基礎
期刊：Nature（IF：42.778）
研究單位：澳大利亞默多克大學西澳洲大麥聯盟

主要研究內容：

作者通過對全球超過2萬份大麥種質資源進行遺傳多樣性分析，最終選出20個能夠覆蓋大部分大麥遺傳多樣性的品種（包括地方種、栽培種及野生種）。結合PacBio、Illumina、10x Genomics、Hi-C等技術構建了20個染色體水平基因組，組裝基因組大小在3.8Gb-4.5Gb，N50范圍為5.0-42.7 Mb。并對不同品種間基因組大片段插入/缺失變異（PAV）、結構變異進行了鑒定。發現大的倒位多態性（>5 Mb）普遍存在，并對經常在優質大麥品種中發現的兩個重要的大片段倒位現象進行了分析。該研究首次構建了大麥泛基因組，檢測了大量未發現的遺傳變異，這些變異將為遺傳分析和育種提供有力支撐。

植物案例二

英文名：Multiple wheat genomes reveal global variation in modern breeding[7] 中文名：多個小麥基因組揭示了現代育種中的全面變異
期刊：Nature（IF：42.778）
研究單位：加拿大薩斯喀徹溫大學等研究單位

主要研究內容：

作者通過通過NRGene DeNovoMagic3平臺結合10X Genomics、Illumina、Hi-C等技術完成了不同地區來源的10個染色體級別和5個scaffold級別的6倍體小麥基因組，組裝結果在14.2Gb-14.8Gb。并通過挖掘不同小麥品種間的基因多樣性，研究了一些農藝相關性狀基因家族。通過基因組比較及ChIP-seq等技術揭示了基因組的轉座子TE差異, 外緣染色體片段, 著絲粒倒位以及10個基因組間大的結構變異(SV)，這些研究揭示了廣泛的結構重排、野生親緣的引入以及復雜的育種歷史導致基因變異，這些育種歷史旨在提高小麥對不同環境的適應能力、產量和質量以及抗逆性。基因組間比較研究發現了一個多基因組衍生的富亮氨酸重復結構域的核苷酸結合蛋白庫，這種蛋白參與了小麥的抗病性，并且報道了抗蟲基因Sm1的基因變異。小麥泛基因組將為發現功能基因和培育下一代現代小麥品種提供理論基礎。

動物案例

英文名：Massive gene presence-absence variation shapes an open pan-genome in the Mediterranean mussel[8] 中文名：地中海貽貝的大規模基因存在缺失變異形成了一個開放的泛基因組
期刊： Genome Biology（IF：10.806）
研究單位：意大利里雅斯特大學

主要研究內容：

作者通過Illumina、PacBio等技術構建了1.28G地中海貽貝基因組（Contig N50=71.42 kb）。并對14個地中海貽貝進行高深度重測序，發現其間具有大量的結構變異，大的插入和缺失是地中海貽貝基因組多樣性的主要來源。進而將重測序數據與組裝基因組比對，并將未比對上的contigs進行組裝，構建了1.86Gb的地中海貽貝泛基因組。對泛基因組中的核心與非核心基因組進行分析，富集分析結果表明，非核心基因在胞凋亡、免疫信號傳導等與環境適應性相關的通路中顯著富集，揭示了地中海貽貝的非核心基因組在增強其環境適應性中的重要作用。

尾聲

隨著技術的飛速發展，各大雜志編輯們“眼光”越來越高，基因組學研究難以再靠單純的基因組生信分析獨樹一幟。如何利用好基因組信息，深入挖掘其中奧義；如何使不同生態型生物學現象得以充分解析；如何使得基因組的數據成為遺傳育種、物種保護中的關鍵信息。種種問題在多組學聯合研究的背景下將迎刃而解。當然，小編在這里更多的是列舉了目前研究最為熱門的幾種方案，對于不同物種特性，真正適合的研究方案遠不止小編列舉的這些，單細胞技術、基因編輯等多種新興技術正在逐步崛起，后續動植物的研究里也會逐漸細致化，精細化。也期待每一位老師能快速找到適合自己的研究方案，完美的闡述各種生物學故事。

參考文獻

[1] Chao G, Yanan W, Aiguo Y et al. The Coix genome provides insights into Panicoideae evolution and papery hull domestication . Mol Plant. 2019.

[2] Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game. Mol Plant., 2019.

[3] Zhang Q, Liang Z, Cui X, Ji C et al. N6-MethyladenineDNA Methylation in Japonica and Indica Rice Genomes and Its Associationwith Gene Expression, Plant Development and Stress Responses. Mol Plant., 2018.

[4] M Wang, LTu, D Yuan, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense. Nature Genetics.2019.

[5] Z Yang, X Ge, Z Yang, et al. Extensive intraspecific gene order and gene structural variations in upland cotton cultivars.Nature Communications.2019

[6] Jayakodi M, Padmarasu S,et al. The barley pan-genome reveals the hidden legacy of mutation breeding. Nature.2020

[7] Walkowiak S, Gao L, et al. Multiple wheat genomes reveal global variation in modern breeding.Nature.2020

[8] Gerdol M, Moreira R, et al. Massive gene presence-absence variation shapes an open pan-genome in the Mediterranean musse. Genome Biology.2020