測序的原理

Sanger
測序原理 https://v.qq.com/x/page/d0124c0k44t.html
illumina
測序原理： https://v.qq.com/x/page/i0770fd7r9i.html
PacBio
第三代 SMRT 單分子測序 https://v.qq.com/x/page/r03534cry7u.html
Ion torrent
測序原理 https://v.qq.com/x/page/v01754s6r82.html
Oxford Nanopore
https://v.qq.com/x/page/v0746ixokzz.html

好的，以下是根據這份講義內容，對第一、二、三代測序技術相關知識的詳細講解：

一、第一代測序技術（Sanger 測序）

（一）背景與歷史

時間：1977 年，Frederick Sanger 和 Coulson 開創了雙脫氧鏈終止法（Sanger 測序法），并完成了第一個噬菌體全基因組的測序。
意義：開啟了現代基因測序的時代，為后續的基因組學研究奠定了基礎。

（二）測序原理

核心方法：基于 DNA 聚合酶的鏈終止反應。通過在 DNA 合成過程中隨機引入標記了不同熒光染料的雙脫氧核苷酸（ddNTP），使 DNA 鏈在不同位置終止。
具體步驟：
1. 模板制備：將待測 DNA 片段克隆到合適的載體中，獲得單鏈 DNA 模板。
2. 引物退火：加入短的引物，使其與模板 DNA 的互補序列結合。
3. 鏈合成與終止：在反應體系中加入 DNA 聚合酶、dNTP（正常脫氧核苷酸）和少量標記了熒光的 ddNTP。DNA 聚合酶從引物開始延伸 DNA 鏈，當隨機遇到一個 ddNTP 時，鏈合成終止。
4. 電泳分離與檢測：將反應產物在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，根據熒光標記的 ddNTP 不同，產生不同顏色的熒光信號，通過檢測熒光信號的位置和顏色，確定 DNA 序列。

（三）特點

優點：
- 準確性高：單次測序的準確性可達 99.9% 以上，適合對準確性要求極高的應用，如基因組參考序列的構建。
- 讀長較長：單次測序讀長可達 500-1000 個堿基，能夠覆蓋較長的 DNA 片段，減少拼接錯誤。
缺點：
- 速度慢：每次測序只能處理一個 DNA 片段，通量低，難以滿足大規模基因組測序的需求。
- 成本高：設備和試劑成本較高，不適合大規模應用。

二、第二代測序技術（Next-Generation Sequencing, NGS）

（一）背景與歷史

時間：2005 年左右，隨著 Roche 454 測序儀和 Illumina Solexa 測序儀的推出，第二代測序技術逐漸成熟并廣泛應用。
意義：極大地提高了測序通量，降低了測序成本，推動了基因組學研究的快速發展，使大規模基因組測序成為可能。

（二）測序原理（以 Illumina 測序為例）

核心方法：基于可逆終止化學和邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis, SBS）技術。
具體步驟：
1. 建庫：
  - DNA 片段化：將待測 DNA 隨機打斷成一定長度的小片段（如 300bp-800bp）。
  - 末端修復與接頭連接：對 DNA 片段的末端進行修復，并連接上特定的接頭序列，使片段能夠固定在測序芯片上。
  - 加 index 標簽：為不同樣本的 DNA 添加獨特的 index 標簽，便于后續數據拆分。
2. Flowcell 芯片準備：

Flowcell 的結構

通道（Lanes）：Flowcell 包含多個通道，每個通道稱為一個 lane。圖中顯示的 flowcell 有八條 lane，意味著可以同時進行八個獨立的測序運行。
表面修飾：每個 lane 的表面都經過化學修飾，以便能夠固定 DNA 片段。這些修飾包括大量的引物，如 P7 和 P5 引物，它們與 DNA 文庫上的接頭序列互補，從而能夠固定 DNA 片段。
Swath 和 Tile：每個 lane 有兩個面，每個面上有三個 swath（區域），每個 swath 包含 16 個 tile（小方格）。因此，每個 lane 總共有 98 個 tile（兩面各 48 個）。整個 flowcell 有 768 個 tile（96 lanes × 8 tiles/lane）。

Flowcell 的功能

DNA 固定：在測序過程中，DNA 片段需要固定在 flowcell 上，以防止在液體流動時被沖走。這是通過 DNA 片段上的接頭與 flowcell 表面的引物結合來實現的。
大規模并行測序：由于 flowcell 上有大量的 tile，每個 tile 可以獨立進行測序反應，因此可以實現大規模并行測序，大大提高測序效率和通量。
測序反應容器：所有的測序反應都在 flowcell 上進行，包括 DNA 的固定、擴增和測序。
- 芯片表面修飾：Flowcell 芯片表面含有大量固定化的引物，與 DNA 片段上的接頭序列互補。
- DNA 固定：將建庫后的 DNA 片段加入 Flowcell，使其與芯片上的引物結合。
1. Cluster 擴增：
  - 橋式 PCR：通過橋式 PCR 擴增，使每個 DNA 片段在芯片上形成一個簇（Cluster），每個簇包含多個相同的 DNA 拷貝，放大信號。
2. 測序：
  - 邊合成邊測序：在反應體系中加入帶有熒光標記的 dNTP 和 DNA 聚合酶。每次只添加一個 dNTP 到 DNA 鏈上，通過激發熒光信號并記錄，確定堿基類型。
  - 信號處理與堿基識別：將熒光信號轉換為堿基序列，生成 fastq 格式的測序數據。

（三）特點

優點：
- 高通量：一次運行可以產生大量的測序數據，適合大規模基因組測序。
- 成本低：單位堿基的測序成本大幅降低，使基因組學研究更加普及。
- 應用廣泛：可用于基因組組裝、變異檢測、RNA 測序、單細胞測序等多種應用。
缺點：
- 讀長短：單次測序讀長較短（通常在 50-300bp），難以處理重復序列和復雜基因組區域。
- 測序時間長：從建庫到測序完成通常需要數天時間。
- 偏向性：由于 PCR 擴增等步驟，可能導致某些區域的測序偏向性。

三、第三代測序技術

（一）PacBio 測序

1. 背景與歷史

時間：2010 年左右，PacBio 公司推出了基于單分子實時測序（SMRT）技術的測序儀。
意義：提供了超長讀長的測序能力，解決了第二代測序技術在處理復雜基因組區域時的局限性。

2. 測序原理

核心方法：單分子實時測序（SMRT）。
具體步驟：
1. SMRT Cell 準備：將待測 DNA 樣本轉移到 SMRT Cell 中，該芯片含有大量零模波導孔（ZMW）。
2. 文庫構建：構建 SMRTbell 文庫，將 DNA 片段連接成環狀結構，便于多次測序。
3. 測序過程：
  - DNA 聚合酶固定：在 ZMW 孔底部固定 DNA 聚合酶。
  - 單分子測序：DNA 模板與聚合酶結合，四種不同熒光標記的 dNTP 被逐個添加到 DNA 鏈上。每次添加一個 dNTP 時，熒光信號被激發并記錄，通過信號分析確定堿基類型。
  - 滾環測序：對于環狀 DNA 模板，聚合酶可以多次繞環測序，提高測序準確性。
4. 數據生成：生成長讀長的測序數據，如 Polymerase Read、Subreads、CLR 和 CCS 等。

3. 特點

優點：
- 超長讀長：平均讀長可達 10-70kb，甚至更長，適合復雜基因組的組裝和結構變異檢測。
- 高準確性：通過多次測序和算法校正，可以獲得高準確性的 HiFi Reads（>99.9%）。
- 無需 PCR 擴增：避免了 PCR 擴增帶來的偏向性，適合低豐度基因的檢測。
缺點：
- 數據量小：單次測序產生的數據量相對較小，適合小規模基因組測序。
- 成本高：測序成本較高，不適合大規模應用。
- 設備昂貴：測序儀價格較高，不適合小規模實驗室購買。

（二）納米孔測序

1. 背景與歷史

時間：2014 年左右，Oxford Nanopore 公司推出了基于納米孔技術的測序儀，如 MinION。
意義：提供了實時、長讀長的測序能力，適合現場快速測序和長片段基因組分析。

2. 測序原理

核心方法：基于納米孔的電信號檢測。
具體步驟：
1. 納米孔準備：選擇合適的生物納米孔或固態納米孔，將其嵌入到合成膜中。
2. DNA 樣本處理：將待測 DNA 樣本連接上測序接頭和馬達蛋白，使其能夠通過納米孔。
3. 測序過程：
  - DNA 通過納米孔：在電場作用下，DNA 鏈在馬達蛋白的牽引下逐個堿基通過納米孔。
  - 電流變化檢測：每個堿基通過納米孔時會引起特定的電流變化，通過檢測電流變化信號，識別堿基序列。
  - 堿基識別：利用機器學習算法將電流信號（Squiggle）轉換為堿基序列。
4. 數據生成：生成長讀長的測序數據，通常以 fastq 格式輸出。

3. 特點

優點：
- 長讀長：可以生成長達數十萬個堿基的測序數據，適合復雜基因組的組裝和結構變異檢測。
- 實時測序：數據可以實時生成和分析，適合快速檢測和現場應用。
- 便攜性：測序設備輕便，如 MinION 適合野外和現場使用。
缺點：
- 高錯誤率：初始測序錯誤率較高（約 5%-15%），但可以通過算法校正和多次測序提高準確性。
- 數據處理復雜：需要復雜的堿基識別算法和軟件進行數據處理。
- 成本高：雖然單次運行成本較低，但設備和試劑成本較高。

總結

第一代測序技術（Sanger 測序）：準確性高、讀長長，但速度慢、成本高，適合小規模、高精度的測序項目。
第二代測序技術（NGS）：高通量、成本低、應用廣泛，但讀長短、有偏向性，適合大規模基因組測序和轉錄組分析。
第三代測序技術（PacBio 和納米孔測序）：長讀長、無需 PCR 擴增、適合復雜基因組分析，但數據量小、成本高、設備昂貴，適合特定應用場景，如基因組組裝、結構變異檢測和現場快速測序。