CD8?T細胞耗竭（T cell exhaustion）是腫瘤免疫治療的核心瓶頸，其表觀遺傳重塑機制（如組蛋白修飾）是當前國自然重點資助的前沿方向。耗竭T細胞（TEX）是指在慢性感染（如持續性病毒感染）或腫瘤微環境中長期暴露于抗原刺激后，功能逐漸失調的CD8?T細胞。研究顯示其在癌癥和慢性病毒感染中經歷代謝和表觀遺傳重塑，削弱了其保護能力。然而，營養代謝對控制TEX分化的表觀遺傳修飾的影響尚不清楚。今天我們帶來一篇Science文章《Nutrient-driven histone code determines exhausted CD8+ T cell fates》，該研究針對腫瘤免疫治療的核心瓶頸——CD8+T細胞耗竭（TEX）展開，首次揭示代謝重編程通過營養依賴的組蛋白修飾決定T細胞分化命運。

• 研究技術：RNA-seq、CUT&Tag、scRNA-seq等（愛基百客均可提供）。

• 核心問題：本研究揭示了乙酰輔酶A合成酶ACSS2和ATP-檸檬酸裂解酶ACLY通過介導不同營養源（乙酸鹽vs.葡萄糖）驅動的組蛋白乙酰化，決定TEX細胞分化命運的關鍵機制。

? ?研究思路 ??

???研究結果???

1.?ACSS2與ACLY在TEFF（效應T細胞）和TEX細胞中的差異表達模式

為了理解選擇性營養物質利用及隨后的乙酰輔酶A（acetyl-CoA）生成如何調節CD8+T細胞分化，研究分析了從腫瘤或急性（Armstrong）與慢性（克隆13）淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）感染中分離出的CD8+T細胞中乙酰輔酶A合成酶Acss2和ATP-檸檬酸裂解酶Acly的轉錄譜（公共單細胞轉錄組數據，圖1A和1B）。另外，研究還從蛋白水平關注了ACSS2與ACLY的表達情況（圖1C和1D）。結果表明，隨著TEX細胞在腫瘤和慢性感染中發展，它們下調ACSS2表達同時維持ACLY表達。這里研究團隊發現了這兩種酶在T細胞耗竭中的表達模式不同。

圖1：ACSS2表達下調，而ACLY表達在TEX細胞中持續存在。

2.?ACSS2和ACLY在TEFF和TEX細胞分化及抗腫瘤和抗病毒免疫中的功能拮抗

使用基因敲除方法研究了ACSS2和ACLY在腫瘤發生和慢性LCMV感染期間TEX細胞形成中的作用。在導致T細胞耗竭的情況下，Acss2的缺失削弱了CD8+T細胞活性，而Acly缺失則增強了它們的功能。

圖2：ACSS2促進TEXprog細胞形成及抗腫瘤/抗病毒反應，而ACLY則起抑制作用。

3.?ACSS2與ACLY決定了TEFF和TEX細胞對底物的選擇性利用

ACSS2和ACLY的差異表達模式及其對TEX細胞形成的影響讓研究團隊提出假設，即乙酸鹽和葡萄糖衍生檸檬酸鹽合成乙酰輔酶A的過程可能在功能性效應T細胞和功能障礙性耗竭T細胞之間存在差異。于是，研究團隊使用穩定同位素示蹤實驗來追蹤乙酰輔酶A的來源。數據表明TEX細胞傾向于利用葡萄糖而非乙酸生成細胞核乙酰輔酶A，這與ACSS2表達降低相一致。

4.?ACSS2和ACLY分別在TEFF和TEX細胞中協調乙酸鹽和葡萄糖介導的組蛋白乙酰化作用

為了研究乙酸鹽和葡萄糖如何被利用來乙酰化組蛋白，利用同位素示蹤（[1,2-13C] acetate 或 [U-13C] glucose）追蹤乙酰基的流向，并結合質譜、流式/質譜流式分析特定組蛋白乙酰化位點。結果表明TEFF細胞優先利用乙酸衍生的乙酰輔酶A來完成所有檢測到的組蛋白乙酰化位點修飾（圖3F），而TEX細胞則傾向于以葡萄糖為主要來源（圖3G）。此外，在CD8+T細胞中敲除Acss2和Acly顯示，與對照組或缺失Acly的細胞相比，缺乏Acss2的TEXprog細胞基于流式細胞術測量的H3K27ac總量降低了近50%，這強調了TEXprog細胞對ACSS2在維持全局組蛋白乙酰化水平方面的高度依賴性（圖3H）。相比之下，Acly的缺失對TEXprog或TEXterm細胞的全局H3K27ac水平沒有影響。實際上，它在TEXterm細胞中趨向于增加H3K27ac（圖3H），這可能是由于在Acly缺陷細胞中觀察到ACSS2的代償性增加（圖3I）。

此外，來自13C-乙酸鹽的組蛋白乙酰化在sgAcss2?CD8+?T細胞中受損，而在sgAcly細胞中增加（圖3J），這再次與ACSS2代償一致（圖3I）。相反，來自13C-葡萄糖的組蛋白乙酰化在sgAcly或sgAcss2?T細胞之間沒有顯著差異。這些發現表明，隨著CD8+T細胞從TEFF分化為TEX細胞，或更準確地說，從TEXprog向TEXterm細胞發展的過程中，它們對組蛋白乙酰化的依賴從ACSS2轉變為ACLY，因此從乙酸鹽轉變為葡萄糖。然而，TEX細胞無法維持與其功能更強的對應細胞（TEFF和TEXprog細胞）相同的全局組蛋白乙酰化水平。

圖3：ACSS2與ACLY在效應T細胞（TEFF）和耗竭T細胞（TEX）中差異調控乙酰輔酶A生成及組蛋白乙酰化修飾。

5.?乙酸鹽衍生的核內乙酰輔酶A促進TEXprog細胞形成

為確定乙酸介導的組蛋白乙酰化和TEXprog細胞分化是否由ACSS2介導的局部核內乙酰輔酶A產生驅動，研究構建了FLAG標記的ACSS2WT、ACSS2NLS（核定位信號標記）和ACSS2NES（核輸出信號標記）的RV過表達載體，并轉導體外激活的P14+CD8+T細胞。這些構建體在CD8+T細胞中產生了類似水平的ACSS2，且具有預期的細胞定位。乙酸依賴性組蛋白乙酰化在ACSS2NLS過表達的CD8+T細胞中最為顯著，證明了核內ACSS2的直接表觀遺傳效應。研究用這三種ACSS2 RV或空載體（EV，pMIG）對照轉導P14+?sgAcss2?CD8+?T細胞，并將供體細胞轉移到隨后感染LCMV-clone 13的小鼠體內。與EV對照和ACSS2NES過表達細胞相比，ACSS2WT和ACSS2NLS過表達的P14+sgAcss2?CD8+T細胞增加了總體和TEXprog供體P14+細胞的比例以及它們產生IFNγ和TNF的能力，盡管ACSS2NLS過表達的效果更為顯著。綜上所述，這些發現強調了乙酸衍生的核內乙酰輔酶A在組蛋白乙酰化和TEXprog細胞形成及功能中的關鍵作用。

6.?ACSS2與ACLY分別與p300和KAT2A共定位

核內乙酰輔酶A通過組蛋白乙酰轉移酶（HAT）的活性來修飾組蛋白。鑒于ACSS2和ACLY對TEX細胞分化和組蛋白乙酰化的影響，作者研究了ACSS2、ACLY與特定HAT之間潛在的協同作用。在P14+CD8?T細胞里，用CRISPR-Cas9把常見HAT基因逐一敲掉，再放入LCMV-clone 13慢性感染小鼠，看缺哪個HAT會改變 TEXprog/TEXterm的比例。結果顯示，sgEp300和sgCrebbp增強了TEXterm細胞的形成，這與sgAcss2的作用相似；而sgKat2a則促進了TEXprog細胞的形成，這與sgAcly的作用類似（圖4A）。這些數據表明，ACSS2與p300（由Ep300編碼）或CBP（由Crebbp編碼）之間，以及ACLY與KAT2A之間存在協同功能。

盡管p300和CBP在結構和功能上密切相關，通常被合稱為p300/CBP，但作者將p300作為ACSS2的功能伙伴進行重點研究，因為在LCMV-克隆13感染期間，與sgCrebbp相比，sgEp300在增強TEXterm細胞和擴增病毒特異性CD8+T細胞方面表現出更強的效果（圖4A）。相應地，p300蛋白在急性刺激的細胞中水平升高，而KAT2A在慢性刺激的細胞中水平上調，這與ACSS2和ACLY的蛋白水平及其各自對TEXprog與TEXterm細胞分化的影響相一致。然后，研究關注了蛋白共定位與相互作用。近鄰連接實驗（PLA）測“距離<40nm的蛋白”會亮，結果顯示在TEFF（急性刺激）里，只看到ACSS2+p300的紅點；在TEX（慢性刺激）里，只看到ACLY+KAT2A的紅點；把ACSS2或ACLY敲掉，紅點消失，證明特異（圖4B和C）。Co-IP+Western blot實驗和熒光顯微鏡也進一步證明內源性ACLY在TEX細胞中與KAT2A相互作用，但不與p300相互作用，而ACSS2在TEFF細胞中特異性地與p300共定位，但不與KAT2A共定位。

研究還進行了功能驗證，在細胞里過表達“帶核定位信號”的ACSS2（ACSS2^NLS），再把p300敲掉，TEXprog細胞積累還是起不來，說明ACSS2必須借p300才有作用；類似地，過表達ACLY^NLS+再敲Kat2a，則TEXprog得以“救回來”，說明ACLY的促TEXterm效應依賴KAT2A。ACSS2^NLS或ACLY^NLS本身都會提高H3K27ac水平，但前提分別是p300或KAT2A存在。

總體而言，這些結果表明ACSS2向p300提供核定位的乙酰輔酶A，促進TEXprog細胞的發育。然而，隨著慢性刺激ACSS2的豐度下降，ACLY提供的乙酰輔酶A支持KAT2A的催化活性占主導地位，促進TEXterm細胞的形成。

圖4：ACSS2與ACLY分別與p300和KAT2A發生相互作用。

7.?ACSS2與ACLY分別協同p300和KAT2A，共同調控組蛋白乙酰化修飾

基于上面的數據，作如下假設：ACSS2-p300復合物通過控制特定基因位點的組蛋白修飾，來調控與TEXprog細胞相關的基因表達；而ACLY-KAT2A復合物則可能控制著決定TEXterm細胞分化的基因位點的乙酰化。在感染后第21天分選兩類CD8?T細胞，做CUT&Tag測序，分別構建H3K27ac、H3K9ac、H4ac的差異修飾區域（DMR）的全基因組圖譜。將DMR與其鄰近基因進行關聯分析后發現，TEXprog和TEXterm細胞中，各自“特征”基因（例如，TEXprog的Tcf7、Bach2和TEXterm的Havcr2、Il10）的乙酰化水平均有升高。但從全基因組角度看，TEXterm的乙酰化總量低于TEXprog（呼應前文流式檢測）。

研究在P14+CD8+T細胞中敲除了Acss2、Acly、Ep300和Kat2a，并檢查了它們在體外或體內的TEX分化，并對H3K27ac、H3K9ac和H4ac進行了CUT&Tag。如預期，由于慢性刺激的CD8+T細胞中ACSS2自然含量較低，sgAcss2和sgscramble?CD8+T細胞之間觀察到的差異修飾區域（DMR）很少。相比之下，將sgAcly細胞與對照組比較，約4838個DMR在H3K27ac、H3K9ac和H4ac上表現出同步增加，包括許多TEXprog特征位點（如Tcf7、Il7R、Sell、Tnf和Id3），而約8793個DMR在TEXterm特征基因位點（如Il10、Runx3、Havcr2和Entpd1）表現出同步減少（圖5A和B）。

基因集富集分析（GSEA）進一步證實了sgAcly細胞中TEXprog分化的增強（圖5C）。Motif分析顯示，sgAcly T細胞中乙酰化增加的DMR高度富集于AP1-bZIP轉錄因子結合基序（如Fos、Jun、AP-1和ATF），這些與T細胞激活、效應功能以及防止CD8+T細胞耗竭相關，而乙酰化減少的DMR則富集于ETS轉錄因子家族成員（圖5D）。此外，Acly和Kat2a依賴的H3K27ac DMR的全基因組重疊揭示了幾個共同靶向位點，包括許多TEXterm位點。相比之下，sgAcly細胞中上調的DMR（作為Acss2依賴位點的代表）與Ep300依賴位點的重疊顯示了許多TEXprog位點（圖5E）。這進一步強調了ACLY和ACSS2分別以KAT2A和p300依賴的方式調節位點特異性組蛋白乙酰化，這與它們的物理相互作用和功能相互依賴性一致。

圖5：ACSS2與ACLY分別協同p300和KAT2A，調控位點特異性的組蛋白乙酰化修飾。

8.?核內ACSS2促進TEXprog細胞分化

鑒于過表達ACSS2NLS能夠促進LCMV-clone 13感染期間的組蛋白乙酰化和TEXprog分化，研究者推測這也可能對抗腫瘤免疫產生有益效果。為了驗證這一點，研究在B16-GP33腫瘤植入后第10天將空載體對照或ACSS2NLS過表達的P14+T細胞過繼轉移到小鼠體內（圖6A）。通過流式細胞術檢測，在轉移后第10天，ACSS2NLS過表達的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）顯示全局H3K27ac和H3K9ac水平增加（圖6B）。此外，對H3K27ac、H3K9ac和H4ac進行的CUT&Tag分析表明，ACSS2NLS過表達的腫瘤浸潤淋巴細胞在TEXprog特征基因（如Tcf7和Bach2）處有特定的組蛋白乙酰化富集（圖6，C和D）。而且，RNA-seq分析顯示ACSS2NLS腫瘤浸潤淋巴細胞中關鍵TEXprog相關基因（Id3、Egr2、Tcf7和Slamf6）表達增加，而關鍵TEXterm相關基因（Id2、Cish和Traf4）表達降低（圖6E）。這些數據證明了核內ACSS2對TILs中TEXprog相關基因表達的影響。即把ACSS2強行送進細胞核（ACSS2^NLS過表達，簡稱OE）不僅能在慢性感染模型里促進TEXprog的形成，還能在腫瘤模型中改善腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的表觀遺傳狀態和功能。

圖6: 細胞核內ACSS2過表達促進TEXprog相關基因座組蛋白乙酰化并增強基因表達。

9.?核內ACSS2過表達和ACLY抑制與ICB協同增強抗腫瘤T細胞應答

研究測試了在腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中強制表達核內ACSS2是否能增強αPD-L1免疫檢查點阻斷（ICB）的治療效果。結果顯示，與空載體（EV）對照組相比，過表達ACSS2-NLS的TILs無論是在單獨作用還是與ICB聯用時，其祖細胞樣耗竭性T細胞（TEXprog）的形成均得到增強（圖7A），細胞因子產量也更高（圖7B）。它們還會遷移至缺氧區域附近。因此，過表達ACSS2-NLS的TILs能有效控制腫瘤，并與ICB表現出強大的協同作用（圖7C）；而使用特異性抑制劑VY-3-135（49）抑制ACSS2則會削弱ICB介導的抗腫瘤免疫應答。

此外，鑒于ACSS2在Acly缺陷型CD8+T細胞中水平升高，研究推斷直接抑制ACLY或許是另一種富集TEXprog細胞并提高ICB療效的方法。的確，使用抑制劑BMS-303141抑制ACLY后，活化的CD8+T細胞中ACSS2的表達顯著增強（圖7D），并在體外耗竭培養中促進了TEXprog細胞的形成。同樣地，在小鼠體內施用BMS-303141也輕微增加了TEXprog的形成，盡管在與ICB聯用組中未觀察到比單獨使用ICB更顯著的效果（圖7E）。然而，BMS-303141與ICB的聯合治療極大地促進了TIL的累積，單獨使用BMS-303141治療也顯示出類似趨勢（圖7F）。相應地，BMS-303141治療能有效抑制腫瘤生長，并以一種依賴于CD8+T細胞的方式與ICB產生協同效應（圖7G）。

圖7：核內ACSS2過表達或ACLY抑制可增強CD8+T細胞的抗腫瘤免疫功能

? ?研究結論???

該研究揭示了在癌癥和慢性病毒感染中，營養代謝對CD8+T細胞耗竭(TEX)分化的影響機制。研究發現TEX細胞通過下調乙酰輔酶A合成酶2(ACSS2)而維持ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)活性,從而將代謝從乙酸轉向檸檬酸。這種代謝轉換通過KAT2A-ACLY相互作用增加了檸檬酸依賴的組蛋白乙酰化，同時通過p300-ACSS2復合物降低了乙酸依賴的組蛋白乙酰化。過表達核定位的ACSS2或抑制ACLY可以防止TEX分化并增強腫瘤特異性T細胞反應。這些發現揭示了一個調控CD8+T細胞分化的營養介導的組蛋白密碼，為基于代謝和表觀遺傳的T細胞治療提供了新思路。

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